杞菊地黃丸中沒食子酸的高效液相色譜電化學檢測

索志榮等

摘 要：目的：建立測定杞菊地黃丸中沒食子酸的高效液相色譜電化學分析方法，并用該方法測定杞菊地黃丸。方法：采用反相高效液相色譜電化學檢測法，以Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）為色譜柱；甲醇-2%醋酸為流動相，梯度洗脫，流速為1.0mL·min-1；檢測電壓為0.7V，柱溫為30℃。結果：沒食子酸濃度在15.81-41.73μg·mL-1（r=0.9992）范圍內線性關系良好，平均回收率（n=3）分別為98.1%（RSD=1.6%）。結論：方法快速，準確，可用于杞菊地黃丸的質量控制。

關鍵詞：高效液相色譜；電化學檢測；杞菊地黃丸；沒食子酸

杞菊地黃丸（濃縮丸）由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（酒制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉八味藥組成，具有滋腎養(yǎng)肝的功效，主要用于肝腎陰虧、眩暈耳鳴、羞明畏光、迎風流淚、視物昏花等癥。其主要成分山茱萸中含有沒食子酸[1]，且研究表明沒食子酸具有良好的抗氧化性能[2]。目前，對酚酸類化合物沒食子酸的分離檢測方法有薄層色譜法[3]，毛細管電泳法[4]，高相液相色譜法[5]，紫外分光光度法[6]等。但對杞菊地黃丸中沒食子酸的檢測未見報道。文章基于電化學檢測器靈敏度高、選擇性好等特性[7]，采用高效液相色譜電化學檢測（HPLC-ECD）法，對杞菊地黃丸中沒食子酸進行了分離和測定。為評價和控制杞菊地黃丸的質量提供了依據(jù)。

1 試劑與儀器

試劑：沒食子酸對照品（購自sigma公司），純度為99.7%；甲醇為色譜純；醋酸為分析純；水為超純水；杞菊地黃丸：蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司（國藥準字Z34020128，批號：1306131、1208091）。

儀器：Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UPH型優(yōu)普系列超純水機（成都超純科技有限公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 溶液配制

2.1 供試品溶液

取杞菊地黃丸40丸，在研缽中研細，過6號篩后，得到杞菊地黃丸粉末樣品。取杞菊地黃丸粉末2g，精確稱量，置于10mL試管中，加入適量甲醇，超聲提取2次，每次15min，濾入25mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，搖勻。取適量用0.45μm微孔濾膜濾過，即得杞菊地黃丸供試品溶液。

2.2 對照品溶液

精密稱取沒食子酸對照品5.24mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，配得沒食子酸濃度為0.21mg·mL-1的對照品溶液，作為儲備液，其它不同濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。

3 色譜條件

ZorbaxSB-C18（150mm×4.6mm，5.0？滋m）色譜柱（美國）；流動相：甲醇-2%醋酸，梯度洗脫，其時間程序為0→30→32→37→40→50min，甲醇體積分數(shù)相應為5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，流速：1.0mL·min-1；電化學檢測器：安培檢測，電壓0.7V，柱溫：30℃。沒食子酸的保留時間為3.530min。色譜圖見圖1。

4 方法學考察與樣品分析

4.1 線性關系考察

精密量取“2.2”項所配的沒食子酸儲備液一定體積于量瓶中，用甲醇稀釋，配成沒食子酸濃度分別為4.2，8.4，16.8，25.2，33.6，42.0μg·mL-1的對照品溶液，進樣10.0μL進行測定，以平均峰面積Y（mAu·s）對濃度C（μg·mL-1）進行線性回歸，沒食子酸回歸方程和相關系數(shù)為：Y=3353.26C-52023.86（r=0.9992）。

4.2 精密度試驗

精密吸取杞菊地黃丸（批號：1306131）的供試品溶液10.0μL，重復進樣6次，進行測定，原兒茶酸峰面積積分值的RSD為1.4%。

4.3 重復性試驗

精密稱量杞菊地黃丸（批號：1306131）粉末約2g共6份，按“2.1”項操作制備供試品溶液后，進行測定，沒食子酸含量的RSD為2.9%。

4.4 穩(wěn)定性試驗

對杞菊地黃丸（批號：1306131）的供試品溶液在8h之內每隔1h進行考察，結果沒食子酸峰面積積分值的RSD為1.8%（n=9）。

4.5 加樣回收率試驗

精密稱量杞菊地黃丸（批號：1306131）粉末約1.0g，共3份，每份分別準確加入1.0mL沒食子酸儲備液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液后，進行測定。沒食子酸的平均加樣回收率（n=3）為98.7%；RSD為2.3%。

4.6 樣品分析

按“2.1”項下操作制備供試品溶液，在“3”項的色譜條件下進樣10.0μL，對其進行檢測，用標準曲線法以峰面積計算含量。結果批號1306131和1208091中沒食子酸含量分別為0.268mg·g-1和0.273mg·g-1。

5 討論

5.1 提取條件的選擇

分別考察了水，20%甲醇，40%甲醇，60%甲醇，80%甲醇及甲醇對提取效率的影響。結果顯示：用甲醇作為溶劑提取時，沒食子酸的提取率最高。

5.2 工作電壓的選擇

以對照品儲備液配制一定濃度的沒食子酸待測液，在“3”項條件下，進樣7.0μL，考察檢測電位范圍為：0.1-0.9V。以沒食子酸在ECD上的響應峰面積對電極的工作電壓作圖，得到其流體動力學伏安圖，如圖2。由圖可以看出：當電位高于0.7V時，沒食子酸的電化學響應出現(xiàn)一個平臺，繼續(xù)提高電位，雖然峰電流繼續(xù)增加，但噪音也明顯增加。故選擇檢測電位為0.7V（vs.Ag/AgCl）。

5.3 色譜條件的優(yōu)化

先后嘗試了不同比例的甲醇-醋酸作為流動相的等度洗脫以及各種梯度洗脫，對色譜條件進行了優(yōu)化。結果表明：不加醋酸或醋酸濃度較低時，色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾，加入醋酸后隨著濃度的增加色譜峰的對稱性增加，且保留時間變化不大，同時考慮到色譜柱的耐酸范圍，故選0.2%醋酸溶液作為一相洗脫液；為得到較好的分離效果，采用梯度洗脫方式。經(jīng)試驗，色譜條件為：流動相為甲醇-2%醋酸，梯度洗脫，時間程序為0→30→32→37→40→50min，甲醇體積分數(shù)相應為5.0%→35.0%→90.0%→90.0%→5.0%→5.0%，色譜分離效果較好。

參考文獻

[1]李秀芬，姜元甲，南勁松，等.HPLC法測定祀菊地黃丸中馬錢普的含量[J].藥物分析雜志，2008，28（5）：785-787.

[2]謝曉艷，劉洪濤，張吉，等.沒食子酸體外抗氧化作用研究[J].重慶醫(yī)科大學學報，2011，36（3）：319-322.

[3]王克英.石榴皮中沒食子酸定性定量方法研究[J].中國中藥雜志，2005，30（15）：1171-1172.

[4]翟海云，楊冰儀，黃慶華，等.毛細管電泳法快速測定五倍子中的沒食子酸[J].分析試驗室，2007，26（11）：35-37.

[5]索志榮，曹煒，秦海燕，等.葡萄酒中4種酚酸類化合物的色譜電化學分析[J].食品科學，2005，26（10）：191-193.

[6]鄧秀霞，李琴，王留留.山茱萸果核中沒食子酸的提取及檢測方法[J].農業(yè)機械，2011（32）：137-140.

[7]索志榮，秦海燕，曹煒，等.復方丹參片中四種成分的高效液相色譜-電化學檢測-紫外檢測法分析[J].色譜，2005，23（6）：626-629.

作者簡介：索志榮，副教授，從事藥物分析研究。