阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織超氧化物歧化酶的影響

張狀

【摘要】 目的 探討阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。方法 選用健康Sprague-Dawley（SD）大鼠， 隨機(jī)分為阿托伐他汀預(yù)處理組、單純?nèi)毖M和假手術(shù)組。阿托伐他汀預(yù)處理組于術(shù)前15 d灌胃阿托伐他汀， 6 mg/（kg·d）， 然后制備大鼠局灶性腦缺血模型， 缺血后24 h行神經(jīng)行為學(xué)評分、化學(xué)比色法測定腦組織勻漿中SOD活性。結(jié)果 與假手術(shù)組比較， 局灶性腦缺血24 h， 腦組織SOD活性明顯下降（P<0.05）。與單純?nèi)毖M比較， 阿托伐他汀預(yù)處理組明顯降低神經(jīng)行為學(xué)評分（P<0.05）， 提高腦組織勻漿SOD活性（P<0.05）。結(jié)論 阿托伐他汀可以改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分， 提高腦組織SOD活性， 增強(qiáng)氧自由基清除作用， 具有神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 阿托伐他汀；局灶性腦缺血；超氧化物歧化酶

缺血性腦損傷是多種因素、多種機(jī)制共同參與的級聯(lián)反應(yīng)過程， 興奮性氨基酸毒性、鈣超載、自由基反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血性腦損傷的重要環(huán)節(jié)[1]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是體內(nèi)主要的抗氧化酶之一， 它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)， 清除超氧陰離子自由基， 具有阻斷自由基的毒性作用[2]， 保護(hù)細(xì)胞免受損傷[2]。腦缺血時體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除自由基的動態(tài)平衡狀態(tài)遭到破壞， 使得SOD減少， 清除自由基能力下降， 氧自由基蓄積， 可導(dǎo)致神經(jīng)元興奮、潰變、死亡， 產(chǎn)生興奮性毒性， 造成廣泛的腦組織病理性損害[3]。本研究從氧自由基的角度來探討阿托伐他汀對缺血性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制， 為臨床尋找新的腦保護(hù)藥物提供一條途徑。

1 材料與方法

1. 1 材料 選用健康SD 大鼠36只， 雌雄各半， 體重180～240 g（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。許可證號：SCXK（遼）200320007。實(shí)驗(yàn)動物級別：普通級。

1. 2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 阿托伐他汀：輝瑞制藥有限公司， 規(guī)格20 mg；SOD試劑盒：南京建成生物工程研究所提供。

1. 3 實(shí)驗(yàn)分組 36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖M、阿托伐他汀預(yù)處理組， 每組12只大鼠。阿托伐他汀預(yù)處理組于術(shù)前灌胃阿托伐他汀， 6 mg/（kg·d）， 共15 d， 假手術(shù)組和單純?nèi)毖M分別予以等量生理鹽水， 療程和給藥方法相同。制備大鼠局灶性腦缺血模型， 每組12只大鼠于缺血后24 h進(jìn)行取材。

1. 4 SD大鼠局灶性腦缺血模型（MCAO）的制備 大鼠局灶性腦缺血模型[4]（middle cerbral artery occlusion， MCAO）手術(shù)前12 h禁食不禁水。選用標(biāo)準(zhǔn)大鼠麻醉劑量， 以10%水合氯醛3 ml/kg， 經(jīng)腹腔麻醉， 仰臥固定于手術(shù)臺上， 頸部正中切開皮膚及淺筋膜， 鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌， 暴露左側(cè)頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)， 頸外動脈（ECA）， 頸內(nèi)動脈（ICA）， ICA的顱外分支——翼腭動脈， 在近心端結(jié)扎CCA， 在頸總動脈分叉處結(jié)扎ECA， 結(jié)扎翼腭動脈。將ICA遠(yuǎn)心端用動脈夾夾閉， 距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口， 插入備好的碳素魚線， 去除動脈夾， 沿著ICA輕輕向前推進(jìn)， 注意不要誤入翼腭動脈， 當(dāng)?shù)竭_(dá)指定長度（18 mm左右）時結(jié)扎ICA并固定魚線。假手術(shù)組動物， 除手術(shù)過程中不插入線栓以外， 其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚。術(shù)后保持環(huán)境溫度在25～30℃左右。尤其要注意動物頭部的保溫。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征。

1. 5 神經(jīng)行為學(xué)評分 參考經(jīng)典的Zea Longa[5]法對大鼠在MCAO術(shù)后清醒后到24 h進(jìn)行3次神經(jīng)功能評分， 取平均值。見表1。

表1 神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)

分?jǐn)?shù) 表現(xiàn)

0 無神經(jīng)功能缺損癥狀， 活動正常

1 輕微神經(jīng)功能缺損， 不能完全伸展對側(cè)前爪

2 中度局灶性神經(jīng)功能缺損， 爬行時出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象）

3 重度局灶性神經(jīng)功能缺損， 行走時身體向?qū)?cè)傾斜

4 不能自發(fā)行走， 意識水平下降

1. 6 化學(xué)比色法測定腦組織勻漿中SOD活力 MCAO術(shù)后， 在固定時間點(diǎn)分別將大鼠各以10%水合氯醛經(jīng)灌胃深度麻醉后置于解剖臺上， 斷頭， 冰盤上經(jīng)枕骨大孔開顱取出腦組織， 用冷生理鹽水沖洗除去血液， 濾紙拭干， 切取左側(cè)大腦頂葉皮質(zhì)約100 mg， 經(jīng)電子天平稱重后放入勻漿器中， 按W/V=1/9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水冰浴下勻漿， 制備10%的腦組織勻漿， 3500 r/min低溫離心， 15 min， 取上清液， 冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫?嚴(yán)格按SOD試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）檢測腦組織勻漿SOD活力。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)等統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響 與假手術(shù)組相比， 單純?nèi)毖M大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀顯著增加（P<0.05）；阿托伐他汀組神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于單純?nèi)毖M（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)

評分的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術(shù) 單純?nèi)毖?阿托伐他汀預(yù)處理

24 h 0 3.42±0.78a 2.85±0.58b

注：與假手術(shù)組相比， aP<0.05；與單純?nèi)毖M相比， bP<0.05

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術(shù)組相比， 單純?nèi)毖M大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術(shù) 單純?nèi)毖?阿托伐他汀預(yù)處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術(shù)組相比， aP<0.05；與單純?nèi)毖M相比， bP<0.05

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細(xì)胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內(nèi)流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產(chǎn)生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產(chǎn)物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經(jīng)行為學(xué)， 腦組織SOD活力的影響。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較， 單純?nèi)毖M大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預(yù)處理組的神經(jīng)行為學(xué)評分低于單純?nèi)毖M（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經(jīng)缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用， 其機(jī)制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用， 為臨床應(yīng)用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Zador Z， Benyo Z， Lacza Z， et al. Neuroprotection in brain ischemia-doubts and hopes.Ideggyogy Sz， 2012， 57（3-4）：81-93.

[2] Fagan SC， Hess DC， Machado LS， et al. Tactics for vascular protection after acute ischemic stroke.Pharmacotherapy， 2013， 25（3）：387-395.

[3] Suzuki Y， Takagi Y， Nakamuro B， et al. Ablity of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischemia damage in rats.Bain Bes， 2013， 964（1）：116-120.

[4] 陳佳俊， 石巖殊， 韓雪梅. 線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（PMCAO）的實(shí)驗(yàn)研究.吉林醫(yī)學(xué)， 2004， 25（10）：16-17.

[5] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke， 1989， 20（1）：84-91.

[6] Sevanian A， Muakkassah-Kelly SF， Montestruque S.The influence of phospholipase A2 and glutathione peroxidase on the elimination of membrane lipid peroxides.Arch Biochem Biophys， 2013（223）：441-452.

[7] Mc-Cord JM， Roy RS， Schaffer SW.Free radicals and myocardial ischemia.The role of xanthine oxidase.Adv Myocardiol， 2011（5）：183-189.

[8] Dawson TM， Dawson VL， Snyder SH.A novel neuronal messenger molecule in brain： the free radical， nitric oxide.Ann Neurol， 2012（32）：297-311.

[9] Brown RH. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs.N Engl J Med， 2011， 352（13）：1376.

[收稿日期：2014-04-24]

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術(shù)組相比， 單純?nèi)毖M大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術(shù) 單純?nèi)毖?阿托伐他汀預(yù)處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術(shù)組相比， aP<0.05；與單純?nèi)毖M相比， bP<0.05

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細(xì)胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內(nèi)流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產(chǎn)生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產(chǎn)物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經(jīng)行為學(xué)， 腦組織SOD活力的影響。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較， 單純?nèi)毖M大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預(yù)處理組的神經(jīng)行為學(xué)評分低于單純?nèi)毖M（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經(jīng)缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用， 其機(jī)制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用， 為臨床應(yīng)用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[9] Brown RH. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs.N Engl J Med， 2011， 352（13）：1376.

[收稿日期：2014-04-24]

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術(shù)組相比， 單純?nèi)毖M大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術(shù) 單純?nèi)毖?阿托伐他汀預(yù)處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術(shù)組相比， aP<0.05；與單純?nèi)毖M相比， bP<0.05

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細(xì)胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內(nèi)流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產(chǎn)生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產(chǎn)物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經(jīng)行為學(xué)， 腦組織SOD活力的影響。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較， 單純?nèi)毖M大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預(yù)處理組的神經(jīng)行為學(xué)評分低于單純?nèi)毖M（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純?nèi)毖M相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經(jīng)缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用， 其機(jī)制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用， 為臨床應(yīng)用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Zador Z， Benyo Z， Lacza Z， et al. Neuroprotection in brain ischemia-doubts and hopes.Ideggyogy Sz， 2012， 57（3-4）：81-93.

[2] Fagan SC， Hess DC， Machado LS， et al. Tactics for vascular protection after acute ischemic stroke.Pharmacotherapy， 2013， 25（3）：387-395.

[3] Suzuki Y， Takagi Y， Nakamuro B， et al. Ablity of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischemia damage in rats.Bain Bes， 2013， 964（1）：116-120.

[4] 陳佳俊， 石巖殊， 韓雪梅. 線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（PMCAO）的實(shí)驗(yàn)研究.吉林醫(yī)學(xué)， 2004， 25（10）：16-17.

[5] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke， 1989， 20（1）：84-91.

[6] Sevanian A， Muakkassah-Kelly SF， Montestruque S.The influence of phospholipase A2 and glutathione peroxidase on the elimination of membrane lipid peroxides.Arch Biochem Biophys， 2013（223）：441-452.

[7] Mc-Cord JM， Roy RS， Schaffer SW.Free radicals and myocardial ischemia.The role of xanthine oxidase.Adv Myocardiol， 2011（5）：183-189.

[8] Dawson TM， Dawson VL， Snyder SH.A novel neuronal messenger molecule in brain： the free radical， nitric oxide.Ann Neurol， 2012（32）：297-311.

[9] Brown RH. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs.N Engl J Med， 2011， 352（13）：1376.

[收稿日期：2014-04-24]