pN0直腸癌患者淋巴結GCC mRNA表達與預后的關系

周小青　歐陽娟　劉曉平　葉軍明　曾桂芳　楊斌　張國輝　葉斌

【摘要】 目的：探討GCC mRNA在淋巴結陰性（pN0）直腸癌患者淋巴結中表達與預后的關系。方法：應用RT-PCR檢測60例pN0直腸癌淋巴結中GCC mRNA表達水平，并分為GCC mRNA陽性組（pN0（mol+））16例與陰性組（pN0（mol-））44例。分析兩組患者的局部復發率、遠處轉移率、無瘤生存期（DFS）與GCC mRNA表達水平的關系。結果：GCC mRNA陰性組的局部復發率及遠處轉移率更低（P<0.05），無瘤生存期更長（P<0.05）；TNM分期中T3～T4淋巴結GCC mRNA表達陽性率明顯高于T1～T2（P<0.05）。結論：GCC mRNA表達水平與患者的預后密切相關，提示GCC mRNA可作為直腸癌淋巴結微轉移的有效分子學檢測指標。

【關鍵詞】 直腸癌； 淋巴結； GCC mRNA； 預后

近30年來，直腸癌外科治療取得長足進步，但5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50%患者死于復發和轉移，其中局部淋巴結轉移是直腸癌復發的重要因素。即使是不存在局部淋巴結轉移的pN0直腸癌，復發率也高達20%～30%，癌細胞在淋巴結中的隱匿性轉移則是pN0直腸癌術后復發轉移的重要因素。鳥苷酸環化酶C（Guanylyl cyclases C，GCC/GUCYC）是受體鳥苷酸環化酶家族成員之一，高選擇性表達于腸道上皮細胞，普遍過表達于結腸直腸癌細胞（>80%），可作為結腸直腸癌的標志分子[1]。本研究應用逆轉錄多聚酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測pN0直腸癌患者淋巴結中GCC mRNA的表達水平，并分析患者預后與GCC mRNA表達水平的關系，以探討GCC mRNA能否作為判斷淋巴結微轉移的可靠指標及其對直腸癌的分子分期以及預后判斷的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月-2012年6月本院收住的60例直腸癌患者，納入標準為：術前腸鏡病理證實為直腸癌，術中清掃淋巴結數≥12枚，術后病理確診系直腸癌且淋巴結無轉移（pN0）。60例患者中，男36例，女24例，男女比例為1.5：1；年齡34～70歲，中位年齡55歲，平均52.3歲；其中低分化腺癌21例，中-高分化腺癌39例；TNM分期：T1 8例，T2 19例，T3 18例，T4 15例。將60例患者根據PT-PCR檢測淋巴結GCC mRNA的表達分為陽性組（pN0（mol+））16例與陰性組（pN0（mol-））44例。

1.2 主要儀器與試劑 Trizol購自Gibco公司，DEPC水購自Spectrum，MMLV逆轉錄試劑盒購自Promega公司，PCR儀為Biosafer 970儀。

1.3 RT-PCR方法檢測GCC mRNA表達

1.3.1 總RNA提取 取淋巴結組織置于2 mL去RNA酶Eppendord管中，加入200 μL Trizol，組織勻漿器研碎后，再加入800 μL Trizol，混勻，靜置5 min使組織充分裂解，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩20 s，室溫靜置2 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，吸取水相加等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，上清液，加75%乙醇1.0 mL清洗，7500×g離心5 min，2次，棄上清液，室溫干燥后DEPC水溶解，測濃度后-70 ℃保存。

1.3.2 PT-PCR 取1 μg總RNA加隨機引物0.5 μg混勻，70 ℃水浴5 min后速冷，加逆轉錄酶200 U、dNTP μL及RNA抑制劑25 U，37℃水浴1 h后置95 ℃ 5 min。擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，共40個循環；最后72 ℃延伸7 min。以水及良性組織淋巴結為陰性對照，并設no RT對照；PCR產物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴乙錠染色；產物序列測序證實。

1.4 病例隨訪 對兩組患者進行密切隨訪，第1～2年，每3個月一次；第3年以后，每6個月一次，隨訪期間常規體格檢查，并予查血CEA、CA19-9、CA72-4，腹盆腔CT，胸部X-Ray；統計分析復發率、遠處轉移率、無瘤生存期等指標。

1.5 統計學處理 采用SPSS 14.0統計學軟件對數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

淋巴結GCC mRNA陽性組復發率及遠處轉移率較陰性組高，無瘤生存期較陰性組短，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。TNM分期中T3～T4淋巴結GCC mRNA表達陽性率明顯高于T1～T2（P<0.05），見表2。兩組不同分期的局部復發和遠處轉移情況見表3。

表1 兩組觀察指標的比較

組別 局部復發

例（%） 遠處轉移

例（%） 2年無瘤生存期（月）

陽性組（n=16） 4（25.00） 4（25.00） 20.06±6.04

陰性組（n=44） 2（4.55） 1（2.27） 23.36±2.29

字2/t值 5.4545 7.934 3.0969

P值 0.0380 0.015 0.0030

3 討論

全球每年因直腸癌死亡的人數高達50多萬，在發達國家發病率僅次于肺癌；目前在我國大城市直腸癌的發病率和死亡率均居第2位。近30年來，直腸癌外科治療取得長足進步，但其5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50%的患者死于腹腔局部或區域的復發和肝轉移，其中局部淋巴結轉移是直腸癌復發的重要預測因素，有局部淋巴結轉移者的復發率高達50%。即使是不存在局部淋巴結轉移的pN0直腸癌患者，復發率也高達20%～30% ，其中癌細胞在淋巴結中的隱匿性轉移則是導致直腸癌術后復發轉移的重要因素。endprint

傳統的分期方法主要借助組織病理學檢測結果，其局限主要體現在：（1）組織病理學檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個正常細胞中檢出1個腫瘤細胞；（2）僅能納入淋巴結的少量淋巴組織進行分析，易遺漏腫瘤細胞；（3）僅能納入少數淋巴結進行分析，易遺漏陽性淋巴結；故pN0并不代表淋巴結沒有腫瘤細胞浸潤。GCC是受體鳥苷酸環化酶家族成員之一，人類GUCYC基因定位于12號染色體，約85 kb，有27個外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細胞及原發或繼發性的結腸直腸惡性腫瘤中表達，是結腸直腸的高度特異性的生物學指標[1-3]。

隨著分子生物技術的發展，尤其是RT-PCR技術的成熟和完善，其應用于檢測隱匿性轉移腫瘤細胞已成為目前研究的熱點[4-6]。RT-PCR技術檢測隱匿性轉移的優越性，從理論上分析，檢測轉移用測定mRNA的RT-PCR優于測定蛋白質的免疫學技術，因為：（1）mRNA在細胞外很不穩定，只要在組織或體液中測出特異性RNA，就意味著有腫瘤細胞的存在；（2）有些腫瘤細胞可轉錄組織特異性抗原的mRNA，但無該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對免疫學技術易行，只要待測基因序列，即可設計引物作RT-PCR，而免疫學技術則需不斷生產特異性抗體；（4）很少量的癌細胞即可被檢出，可以檢出約106～107個正常細胞中夾雜的1個腫瘤細胞；（5）可以同時對大量標本進行檢測并且整個過程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結組織的RNA進行檢測，克服了傳統組織學檢查和免疫組織化學方法只能切取數個淋巴結切面的缺點。

本研究利用RT-PCR檢測pN0直腸癌患者淋巴結中GUCYG mRNA的表達情況，分析不同表達與預后之間的關系。研究顯示淋巴結GCC mRNA陽性表達組復發率與遠處轉移率較陰性組高，2年無瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結GCC mRNA表達陽性組預后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結GCC mRNA表達陽性率明顯高于T1～T2，但5年的無瘤生存期、總生存期及相關亞組分析還有待進一步觀察；對于GCC mRNA陽性表達者預后差，具體機制還有待探索，可能同GCC mRNA通過cGMP依賴的相關機制來調節大腸癌細胞的增殖和分化有關[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結隱匿性轉移的可靠指標，對直腸癌的分子生物學分期以及預后判斷有指導意義，可為直腸癌的治療方案提供依據。

參考文獻

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[3] Frick G S，Pitari G M，Winberg D S，et al.Guanylyl cyclases C：a molecular marker for staging and postoperatative surveillance of patients with colorectal cancer [J].Expret Rev Mol Diagn，2005， 5（5）：701-713.

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[5] Chen G，Mclver C M，Texler M，et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patents： a multiple-marker reverse transcriptase polymetase chain reaction study[J].Dis Colon Rectum，2004，47（5）： 679-686.

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[8] Nrimalya Basu，Sayanti Saha，Imran Khan，et al.Intestinal cell proliferation and senescence are regulated by receptor guanylyl cyclase C and p21[J].J Biol Chem，2014，289（1）：581-593.

[9] Bustin S A，Siddiqi S，Ahmed S，et al.Quantification of cytokeratin 20， carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer，2004，108（3）：412-417.

[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文編輯：蔡元元）endprint

傳統的分期方法主要借助組織病理學檢測結果，其局限主要體現在：（1）組織病理學檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個正常細胞中檢出1個腫瘤細胞；（2）僅能納入淋巴結的少量淋巴組織進行分析，易遺漏腫瘤細胞；（3）僅能納入少數淋巴結進行分析，易遺漏陽性淋巴結；故pN0并不代表淋巴結沒有腫瘤細胞浸潤。GCC是受體鳥苷酸環化酶家族成員之一，人類GUCYC基因定位于12號染色體，約85 kb，有27個外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細胞及原發或繼發性的結腸直腸惡性腫瘤中表達，是結腸直腸的高度特異性的生物學指標[1-3]。

隨著分子生物技術的發展，尤其是RT-PCR技術的成熟和完善，其應用于檢測隱匿性轉移腫瘤細胞已成為目前研究的熱點[4-6]。RT-PCR技術檢測隱匿性轉移的優越性，從理論上分析，檢測轉移用測定mRNA的RT-PCR優于測定蛋白質的免疫學技術，因為：（1）mRNA在細胞外很不穩定，只要在組織或體液中測出特異性RNA，就意味著有腫瘤細胞的存在；（2）有些腫瘤細胞可轉錄組織特異性抗原的mRNA，但無該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對免疫學技術易行，只要待測基因序列，即可設計引物作RT-PCR，而免疫學技術則需不斷生產特異性抗體；（4）很少量的癌細胞即可被檢出，可以檢出約106～107個正常細胞中夾雜的1個腫瘤細胞；（5）可以同時對大量標本進行檢測并且整個過程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結組織的RNA進行檢測，克服了傳統組織學檢查和免疫組織化學方法只能切取數個淋巴結切面的缺點。

本研究利用RT-PCR檢測pN0直腸癌患者淋巴結中GUCYG mRNA的表達情況，分析不同表達與預后之間的關系。研究顯示淋巴結GCC mRNA陽性表達組復發率與遠處轉移率較陰性組高，2年無瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結GCC mRNA表達陽性組預后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結GCC mRNA表達陽性率明顯高于T1～T2，但5年的無瘤生存期、總生存期及相關亞組分析還有待進一步觀察；對于GCC mRNA陽性表達者預后差，具體機制還有待探索，可能同GCC mRNA通過cGMP依賴的相關機制來調節大腸癌細胞的增殖和分化有關[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結隱匿性轉移的可靠指標，對直腸癌的分子生物學分期以及預后判斷有指導意義，可為直腸癌的治療方案提供依據。

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[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文編輯：蔡元元）endprint

傳統的分期方法主要借助組織病理學檢測結果，其局限主要體現在：（1）組織病理學檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個正常細胞中檢出1個腫瘤細胞；（2）僅能納入淋巴結的少量淋巴組織進行分析，易遺漏腫瘤細胞；（3）僅能納入少數淋巴結進行分析，易遺漏陽性淋巴結；故pN0并不代表淋巴結沒有腫瘤細胞浸潤。GCC是受體鳥苷酸環化酶家族成員之一，人類GUCYC基因定位于12號染色體，約85 kb，有27個外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細胞及原發或繼發性的結腸直腸惡性腫瘤中表達，是結腸直腸的高度特異性的生物學指標[1-3]。

隨著分子生物技術的發展，尤其是RT-PCR技術的成熟和完善，其應用于檢測隱匿性轉移腫瘤細胞已成為目前研究的熱點[4-6]。RT-PCR技術檢測隱匿性轉移的優越性，從理論上分析，檢測轉移用測定mRNA的RT-PCR優于測定蛋白質的免疫學技術，因為：（1）mRNA在細胞外很不穩定，只要在組織或體液中測出特異性RNA，就意味著有腫瘤細胞的存在；（2）有些腫瘤細胞可轉錄組織特異性抗原的mRNA，但無該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對免疫學技術易行，只要待測基因序列，即可設計引物作RT-PCR，而免疫學技術則需不斷生產特異性抗體；（4）很少量的癌細胞即可被檢出，可以檢出約106～107個正常細胞中夾雜的1個腫瘤細胞；（5）可以同時對大量標本進行檢測并且整個過程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結組織的RNA進行檢測，克服了傳統組織學檢查和免疫組織化學方法只能切取數個淋巴結切面的缺點。

本研究利用RT-PCR檢測pN0直腸癌患者淋巴結中GUCYG mRNA的表達情況，分析不同表達與預后之間的關系。研究顯示淋巴結GCC mRNA陽性表達組復發率與遠處轉移率較陰性組高，2年無瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結GCC mRNA表達陽性組預后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結GCC mRNA表達陽性率明顯高于T1～T2，但5年的無瘤生存期、總生存期及相關亞組分析還有待進一步觀察；對于GCC mRNA陽性表達者預后差，具體機制還有待探索，可能同GCC mRNA通過cGMP依賴的相關機制來調節大腸癌細胞的增殖和分化有關[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結隱匿性轉移的可靠指標，對直腸癌的分子生物學分期以及預后判斷有指導意義，可為直腸癌的治療方案提供依據。

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[5] Chen G，Mclver C M，Texler M，et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patents： a multiple-marker reverse transcriptase polymetase chain reaction study[J].Dis Colon Rectum，2004，47（5）： 679-686.

[6]萬遠廉，潘義生，劉玉村，等.RT-PCR 方法診斷的癌淋巴結微轉移[J].中國實用外科雜志，2000，20（1）：47-48.

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[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

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