炎癥致巨噬細胞和血管平滑肌細胞低密度脂蛋白受體反饋調控差異的研究＊

葉 強，雷 寒，范忠才，鄭文武，鄭舒展（．瀘州醫學院附屬醫院心血管內科，四川瀘州 646000；2．重慶醫科大學附屬第一院心血管內科 40006）

低密度脂蛋白受體（LDLr）是結合血漿LDL膽固醇及調控血漿膽固醇濃度的主要受體。LDLr活性受依賴于細胞內膽固醇水平的負反饋系統的嚴密調控，細胞內膽固醇處于穩態水平，故生理條件下天然LDL孵育細胞不能致細胞泡沫化［1］。LDLr抑制50%所需LDL濃度定義為IC50（Inhibition Concentration50），代表LDLr下調敏感性。

本課題組以往研究顯示，炎癥應激可以擾亂人腎臟系膜細胞和肝臟細胞LDLr反饋調控，允許膽固醇攝入增加，導致過多膽固醇沉積。同時實驗顯示，肝細胞和腎臟系膜細胞對膽固醇攝取有不同的能力和敏感性。生理條件下，腎臟系膜細胞LDLr對膽固醇負荷誘導的下調反應比肝細胞敏感，而肝細胞LDLr對下調表現出抵抗表型。然而，炎癥應激改變了LDLr調控從敏感到抵抗的表型，從而增加了腎臟系膜細胞LDL攝入閾值，使腎臟系膜細胞從功能上類似肝細胞最大化攝入LDL，導致泡沫化［2－8］。巨噬細胞和血管平滑肌細胞均為脂質代謝的外周細胞，也是參與動脈硬化的主要細胞類型。然而，LDLr調控差異在外周細胞中仍不是很清楚。本研究探討生理條件下，人單核細胞系（THP－1）巨噬細胞和血管平滑肌細胞LDLr負反饋調控的差異，以及炎癥應激怎樣以細胞特異性方式改變LDLr反饋調控。

1 材料與方法

1．1 材料 THP－1購于美國典藏生物中心（ATCC），No：TIB－202；人原代冠狀動脈平滑肌細胞（VSMCs）購于TCS cell works（Buckinghamshire，UK）；細胞生長培養基 DMEM／F12、RPMI1640、胎牛血清（FCS）購于北京 Hyclone公司。小牛血清清蛋白（BSA）、青霉素、鏈霉素、LPS（Escherichia coli）、佛波酯（PMA）、四乙酸乙二胺（EDTA）、叔丁基對甲酚（BHT）和二甲基亞砜（DMSO）均購于美國Sigma公司。LDL采用兩步法密度梯度超速離心方法，從人新鮮液體血漿中自行制備；細胞內膽固醇測定試劑購于美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購于大連Takara公司；逆轉錄試劑盒購于美國ABI公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養及分組 THP－1生長至對數期，加入PMA誘導分化為巨噬細胞，實驗培養基（為含抗氧化劑EDTA及BHT的無血清培養基）培養24h，進入實驗分組；VSMCs在生長培養基中生長至實驗所需數量后，用實驗培養基處理24h，進入實驗分組，對照組：實驗培養基繼續培養；高脂組：實驗培養基中加入LDL，終濃度為0～200μg／mL；高脂加LPS刺激組：實驗培養基中加入LDL，再加入LPS，終濃度為0～1 000 ng／mL；以上各組細胞培養24h后收獲。

1．2．2 總RNA提取及反轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR） 根據RNAiso試劑盒操作說明分別提取實驗THP－1單核細胞、THP－1巨噬細胞和VSMCs細胞總RNA，500ng總RNA作為模板，選用 ABI逆轉錄試劑盒，逆轉錄體系20μL，含：50 mmol／l KCl，10mmol／L Tris．HCl，5mmol／L MgCl2，每 種dNTP濃度為1mmol／L，2．5μmol／L六堿基隨機引物，20U RNAsin和50UMoloney小鼠白血病病毒；逆轉錄在DNA Thermal Cycler（Eppendorf）中進行，參數為：25℃ 10min，37℃120min，85℃5s；cDNA合成后，用SYBR Green I PCR Master Mix（Takara）在Opticon 2RT－PCR Detector（Bio－Rad）進行熒光定量PCR反應，熱循環條件包括50℃2min，95℃5 min，95℃20s，55℃20s，共40個循環，95℃1min，55℃ 1 min，55～95℃每增加0．5℃讀板，作溶解曲線。實驗在細胞水平重復4次。β－actin作為參照基因。RRl－PCR結果以CT值來表示起始模板的數量，CT值越小起始模板的數量越大。本實驗均用比較CT值法－ΔΔCT來表示基因的表達水平，計算公式如下：實驗組相對于對照組基因表達水平的倍數＝－exp（ΔΔCT），其中ΔΔCT＝實驗組ΔCT－對照組ΔCT，ΔCT＝靶基因CT值－β－actin CT值。引物序列：LDLr上游5′－GTG TCA CAG CGG CGA ATG－3′，下游 5′－CGC ACT CTT TGA TGG GTT CA－3′；SREBP2 上 游 5′－CCG CCT GTT CCG ATG TAC AC－3′，下游 5′－TGC ACA TTC AGC CAG GTT CA－3′；SCAP上游 5′－GGG AAC TTC TGG CAG AAT GAC T－3′，下游5′－CTG GTG GAT GGT CCC AAT G－3′；β－actin上游5′－CCT GGC ACC CAG CAC AAT－3′，下游5′－GCC GAT CCA CAC ACG GAG TAC T－3′；所有引物由ABI公司Primer Express Software version 2．0System設計。

1．2．3 細胞內膽固醇濃度測定 測定THP－1巨噬細胞和VSMCs內膽固醇濃度采用酶染色法，細胞經實驗條件處理24h后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，氯仿／甲醇2∶1混合物提取細胞內脂質，后真空干燥，Lowry法測定細胞總蛋白含量，酶法測定總膽固醇濃度（TC），游離膽固醇濃度（FC），經公式膽固醇酯（CE）＝TC－FC，計算出膽固醇酯水平，最后結果用細胞蛋白含量校正。

1．3 統計學方法 統計學分析由SPSS17．0統計軟件處理，計量數據用±s表示，采用兩樣本比較t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 生理條件 下，THP－1 單核細胞、THP－1 巨 噬 細 胞 和VSMCs LDLr mRNA水平的比較 生理條件下，THP－1單核細胞的LDLr mRNA水平最高（1），經佛波酯（PMA）誘導分化為巨噬細胞后，其LDLr mRNA表達水平下降（0．26±0．11），VSMCs LDLr mRNA水平（0．12±0．05）較 THP－1巨噬細胞低，差異均有統計學意義（P＜0．05）。

圖1 LDL及LPS負荷對巨噬細胞和血管平滑肌細胞LDLr mRNA水平的影響

2．2 LDL和LPS對THP－1巨噬細胞和VSMCs LDLr mRNA水平的影響 實驗數據提示，LDL呈濃度依賴性抑制THP－1巨噬細胞和VSMCs LDLr mRNA表達水平（圖1A）。用直線回歸方程計算兩種細胞LDLr mRNA被抑制50%的LDL濃度即IC50，VSMCs的IC50為11．25μg／mL，而 THP－1巨噬細胞IC50為18．125μg／mL，提示在生理條件下，當LDL負荷時VSMCs LDLr mRNA反饋調控較THP－1巨噬細胞敏感迅速。圖1B顯示，當給予THP－1巨噬細胞和VSMCs不同濃度LPS處理后，LDL對LDLr mRNA反饋抑制效應被逆轉，LPS呈濃度依賴性上調LDLr mRNA水平。通過計算發現，200ng／mL LPS使 THP－1巨噬細胞LDLr mRNA上調0．33倍，而相同濃度LPS僅使VSMCs LDLr mRNA上調0．04倍，400ng LPS使VSMCs LDLr mRNA上調0．22倍。這些數據提示，在 LPS刺激 下，THP－1巨 噬細胞 LDLr mRNA 比VSMCs更容易上調。本實驗確定，25μg／mL LDL作為后續實驗中兩種細胞抑制LDLr mRNA有效濃度，200ng／mL LPS作為THP－1巨噬細胞有效炎癥刺激濃度，400ng／mL作為VSMCs有效炎癥刺激濃度。

2．3 細胞內膽固醇水平測定結果 當細胞培養基中僅有25 μg／mL LDL存在時，兩種細胞內膽固醇水平輕度增加，當同時有200、400ng／mL LPS存在時，細胞內膽固醇水平顯著增加。應用LDLr阻斷劑肝素鈉（heparin）后，兩種細胞內膽固醇水平顯著減少，而清道夫受體阻斷劑聚肌苷酸鈉［Poly（I）］不能減少巨噬細胞內膽固醇沉積（圖2A）。同時通過計算發現，200 ng／mL LPS使巨噬細胞內膽固醇酯水平增加3．21μg／mg，而400ng／mg LPS使VSMCs內膽固醇酯水平增加1．44μg／mg，提示在LPS刺激下，THP－1巨噬細胞通過LDLr途徑聚集更多膽固醇酯。

2．4 LPS對THP－1巨噬細胞及 VSMCs SREBP2和SCAP mRNA水平的影響 25μg／mL LDL抑制THP－1巨噬細胞SREBP2和SCAP mRNA水平（0．71±0．61和0．76±0．32），200ng／mL LPS打破25μg／mL LDL對上述兩種基因的反饋抑制效應，上調其表達（1．69±0．31和1．21±0．52）；25μg／mL LDL抑制VSMCs SREBP2和SCAP mRNA水平（0．25±0．09和0．53±0．13），400ng／mL LPS打破25μg／mL LDL對SREBP2和SCAP mRNA的反饋抑制效應，上調其表達（0．41±0．20和1．01±0．38）。比較分析顯示，25μg／mL LDL負荷下，巨噬細胞SREBP2和SCAP mRNA受抑制程度不及VSMCs，而LPS刺激下，巨噬細胞SREBP2和SCAP mRNA表達升高程度大于VSMCs，這一結果同兩種細胞LDLr mRNA水平及細胞內膽固醇水平比較結果一致。

圖2 LPS對巨噬細胞和平滑肌細胞內膽固醇水平的影響

3 討 論

傳統觀念認為，巨噬細胞是泡沫細胞的主要來源，因為巨噬細胞表達清道夫受體；然而本研究發現平滑肌細胞也可以轉化為泡沫細胞。Rosenfeld和Ross［9］應用放射自顯影技術和細胞特異性標志物的免疫染色法，發現在WHHL兔的進展期斑塊上有30%細胞為巨噬細胞表型，而45%細胞為平滑肌細胞表型。

本研 究觀察 THP－1單核細 胞、THP－1巨噬細 胞 和VSMCs LDLr mRNA水平差別，發現單核細胞LDLr mRNA水平最高，其次為巨噬細胞，最低者為VSMCs。研究發現，生理條件下THP－1巨噬細胞和VSMCs的LDLr對LDL負荷有不同的敏感性和反應能力。如圖1A示，VSMCs的IC50比THP－1巨噬細胞低，提示VSMCs的LDLr下調比THP－1巨噬細胞的LDLr敏感，即攝入外源性膽固醇能力弱于巨噬細胞，攝入膽固醇僅用于保證細胞基本功能，不易泡沫化，而巨噬細胞的LDLr對下調不敏感，允許更多膽固醇進入細胞；加入炎癥刺激物LPS后，在兩種細胞均能觀察到LPS克服LDL負荷對LDLr mRNA反饋抑制效應，LDLr mRNA表達均增高，提示LPS誘導的炎癥應激打破了LDL負荷下的LDLr負反饋調控，允許過多的LDL經LDLr途徑進入細胞內，致泡沫細胞形成（圖2）。本研究還發現，200ng／mL LPS使 THP－1巨噬細胞LDLr mRNA上調0．33倍，而相同濃度LPS僅上調VSMCs mRNA 0．04倍，提示THP－1巨噬細胞的LDLr對LPS誘導的上調效應比VSMCs敏感。進一步細胞內膽固醇測定證實，200ng／mL LPS刺激下，THP－1巨噬細胞內膽固醇酯增加3．21μg／mg，400ng／mL LPS僅增加VSMCs內膽固醇酯1．44μg／mg，這一結果與兩種細胞LDLr對LPS的上調效應的差異一致。為了排除清道夫受體途徑參與細胞內膽固醇聚集，分別使用清道夫受體阻斷劑聚肌苷酸鈉Poly（I）和LDLr抑制劑肝素鈉（heparin）。實驗發現Poly（I）不能減少LPS誘導的細胞內膽固醇聚集，而肝素鈉抑制LPS誘導的膽固醇沉積（圖2）；同時培養基中含有強力抗氧化劑BHT和EDTA，因而細胞內膽固醇沉積可以除外清道夫受體和氧化LDL參與，這些數據提示LDLr是炎癥應激下THP－1巨噬細胞和VSMCs內膽固醇聚集的主要途徑之一；并且THP－1巨噬細胞和VSMCs對于LDL和LPS負荷具有明顯細胞差異性，即LDLr在細胞膜上表達水平高低不是決定胞內膽固醇水平的因素，LDLr反饋調控的差異性才是決定胞內膽固醇水平的關鍵。

繼續研究LPS逆轉高濃度LDL對LDLr反饋抑制的分子機制，發現調控LDLr表達的兩個重要分子SREBP2和SCAP的mRNA水平同樣可以被高濃度LDL抑制；但是相同濃度LDL負荷時，VSMCs的SCAP和SREP2mRNA被抑制程度更大，而LPS同樣可以逆轉高濃度LDL對SCAP和SREBP2的mRNA抑制，上調兩種基因表達，但THP－1巨噬細胞的上調幅度更大（圖2）。這些數據提示，LPS誘導的炎癥應激徹底打破了細胞內膽固醇負反饋調控，上調SCAP和SREBP2表達，可能導致SCAP過多從內質網轉位至高爾基體，進而上調LDLr表達，促進天然LDL進入胞內，致泡沫細胞形成。

綜上所述，生理條件下，THP－1巨噬細胞和血管平滑肌細胞對膽固醇負荷有不同能力和敏感性，巨噬細胞由于其LDLr對LDL負荷不敏感，因而對LDL攝取能力較強，而VSMCs對LDL負荷敏感，LDLr表達迅速下調。LPS誘導的炎癥應激顯著增加巨噬細胞LDLr表達，致泡沫細胞形成。VSMCs LDLr對LPS誘導的上調效應不敏感，這可能是炎癥應激下巨噬細胞更容易泡沫化的原因。

［1］ Nohturfft A，Yabe D，Goldstein JL，et al．Regulated step in cholesterol fee dback localized to budding of SCAP from ER membranes［J］．Cell，2000，102（3）：315－323．

［2］ C hen Y，Ruan XZ，Li Q，et al．Inflammatory cytokines disrupt LDL－receptor feedback regulation and cause statin resistance：a comparative study in human hepatic cells and mesangial cells［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2007，293（3）：F680－F687．

［3］ Ma KL，Ruan XZ，Powis SH，et al．Inflammatory stress exacerbates lipid accumulation in hepatic cells and fatty livers of apolipoprotein E knockout mice［J］．Hepatology，2008，48（3）：770－781．

［4］ R uan XZ，Moorhead JF，Varghese Z．Lipid redistribution in renal dysfunction［J］．Kidney Int，2008，74（4）：407－409．

［5］ C hen YX，Ruan XZ，Huang AL，et al．Mechanisms of dysregulation of low－density lipoprotein receptor expression in HepG2cells induced by inflammatory cytokines［J］．Chin Med J（Engl），2007，120（24）：2185－2190．

［6］ Zhao L，Chen Y，Tang R，et al．Inflammatory stress exacerbates hepatic cholesterol accumulation via increasing cholesterol uptake and de novo synthesis［J］．J Gastroenterol Hepatol，2011，26（5）：875－883．

［7］ Xu ZE，Chen Y，Huang A，et al．Inflammatory stress exacerbates lipid－mediated renal injury in ApoE／CD36／SRA triple knockout mice［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2011，301（4）：713－722．

［8］ Qiang Ye，Han Lei，Zhongcai Fan，et al．Difference in LDL receptor feedback regulation in macrophages and vascular smooth muscle cells：foam cell transformation under inflammatory stress［J］．Inflammation，2014，37（2）：555－565

［9］ Rosenfeld ME，Ross R．Macrophage and smooth muscle cell proliferation in atherosclerotic lesions of WHHL and comparably hypercholesterolemic fat－fed rabbits［J］．Arteriosclerosis，1990，10（5）：680－687．