多耐藥銅綠假單胞菌抗藥基因檢測及對常用消毒劑的抗性分析＊

欒耀芳，王 冠，王婧男，李 穩，張 苗（山東中醫藥大學附屬醫院：．檢驗科；．周圍血管科，濟南 500）

近些年，隨著抗菌藥物的大量及不規范使用，銅綠假單胞菌的耐藥性不斷增強，多耐藥銅綠假單胞菌的檢出率越來越高，給治療帶來很大困難［1］。不僅如此，消毒產品的使用，也使細菌對某些消毒劑產生抗性，容易造成環境消毒失敗，導致醫院感染暴發。為了解本院分離的多耐藥（部分泛耐藥）銅綠假單胞菌qacE△1－sul 1的攜帶情況及對常用消毒劑三氯異氰尿酸、聚維酮碘、戊二醛的體外抗性，作者進行了銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子qacE△1－sul 1的檢測及上述3種消毒劑對10株多耐藥銅綠假單胞菌的殺滅率檢測，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1．1 菌株來源 收集2012年1月至2013年3月住院患者痰液、尿液、分泌物及血液標本中分離的多耐藥銅綠假單胞菌10株（剔除同一患者同一部位細菌），經VITEK 2Compact全自動細菌鑒定／藥敏分析系統鑒定（舒普深、美洛培南運用K－B法，紙片購自英國Oxoid公司）。質控菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853，產酸克雷伯ATCC○R700324。

1．2 儀器 VITEK 2Compact全自動細菌鑒定／藥敏分析系統（法國梅里埃公司）；PTC－200PCR 儀（Bio－Rad公司）；AlphaImagerTM2200型凝膠成像儀（Alpha公司）。

1．3 試劑

1．3．1 利爾康泡騰消毒片Ⅱ型 批號：130109，有效期至2015年1月8日，有效成分：三氯異氰尿酸，有效氯濃度：每片（500±50）mg。

1．3．2 利爾康牌聚維酮碘消毒液 批號：130121A，有效期至2015年1月20日，有效碘濃度：4．5～5．5g／L。

1．3．3 2%強化戊二醛消毒液 批號：130322，有效期至2015年3月21日，戊二醛濃度：（2．2±0．2）%。

1．3．4 中和劑 購自百博生物技術有限責任公司。

1．4 方法

1．4．1 細菌懸液配制 取培養24h的純菌落，以磷酸緩沖液制備濃度為（1～1．5）×108cfu／mL菌懸液備用。

1．4．2 消毒液配制 按消毒劑有效濃度分別以無菌硬水配制不同濃度消毒劑（試驗前新鮮配制）。

1．4．3 中和劑選擇試驗 根據中華人民共和國國家標準《消毒與滅菌效果的評價方法與標準GB15981－1995》要求，確認購自百博生物技術有限責任公司的碘中和劑、氯中和劑、醛類中和劑能夠滿足要求。

1．4．4 耐藥基因檢測 根據GenBank公布的耐藥基因序列，用Primer Premier 5．0軟件自行設計引物，引物qacE△1－sul 1 P1：5′－TAG CGA GGG CTT TAC TAA GC－3′；P2：5′－ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG－3′。其擴增后產物長度300 bp［2－4］。細菌DNA 提取：按 OMEGA公司提供試劑盒操作。基因擴增采用PCR法，反應體系：10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5μL，dNTP Mixture（各2．5mmol／L）4μL，rTaq（5U／μL）0．25μL，DNA模板100ng，上游引物（5μmol／L）4μL，下游引物（5μmol／L）4μL，無菌水補足至50μL。反應條件：95℃預變性5min；94℃變性20s，55℃退火20s（每個循環降0．5℃），72℃延伸30s，共35個循環；72℃總延伸5min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果。

1．4．5 懸液定量殺菌試驗 按照中華人民共和國國家標準《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》附錄C“消毒劑定量消毒試驗”方法進行。

2 結 果

2．1 細菌耐藥狀況 10株多耐藥銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥狀況見表1。

2．2 抗藥基因檢測結果 10株臨床分離的多耐藥銅綠假單胞菌抗藥基因qacE△1－sul 1PCR產物電泳結果見圖1。其中菌株編號為P2、P12、P13標本有很強的擴增；P6、P10、P11擴增稍弱，但仍能看到明顯的目的帶；P3、P4、P9、P14標本無擴增。

表1 10株多耐藥銅綠假單胞菌耐藥狀況

圖1 10株多耐藥銅綠假單胞菌qacE△1－sul 1基因PCR產物電泳圖

2．3 懸液定量殺菌試驗結果

2．3．1 三氯異氰尿酸試驗 結果表明，濃度為125mg／L的三氯異氰尿酸溶液作用1min的殺滅率為99．63%～100．00%；濃度為250mg／L的三氯異氰尿酸溶液作用1min的殺滅率為99．81%～100．00%；濃度為125、250mg／L的三氯異氰尿酸溶液作用3、5min的殺滅率及濃度為500mg／L時溶液作用1、3、5min的殺滅率均為100．00%。

2．3．2 聚維酮碘試驗 結果表明，有效碘濃度為125mg／L的聚維酮碘溶液作用0．5min的殺滅率為99．91%～100．00%，其作用1、3min和濃度分別為250、500mg／L作用0．5、1、3min的殺滅率均達100．00%。

2．3．3 戊二醛試驗 結果表明，濃度為250mg／L的戊二醛溶液作用1min的殺滅率為65．46%～99．75%；濃度為500 mg／L的戊二醛溶液作用1min的殺滅率為99．84%～100．00%，這兩種濃度作用3min和5min的殺滅率均達100．00%。

3 討 論

銅綠假單胞菌分布范圍廣，生存能力強，長期應用激素、免疫制劑，進行化療、放療等導致患者免疫功能低下，以及手術后或某些侵入性操作下的患者易感染該菌［5］。加上廣譜抗菌藥物的大量和不合理使用，銅綠假單胞菌對多種抗菌藥物產生了耐藥性，給臨床治療帶來很大困難，為有效控制醫院感染，消毒劑的合理正確使用必不可少。但因消毒劑的使用已有相當長的歷史，如同細菌對抗菌藥物的耐藥性一樣，長時間接觸同一種（類）消毒劑的細菌會對該類消毒劑產生抵抗力，即產生抗性［6］。文獻報道多種細菌qacE△1－sul 1基因攜帶率高［2，7］。因此，及時了解細菌對消毒劑的抗性，科學選擇、使用消毒產品，避免消毒失敗，對醫院感染控制意義重大。

研究發現，qac基因家族已有 A、B、C、D、E、E△1、F、G、H、J 10種，可以表達多種化合物外排泵（multidrug efflux pump）。qacE△1為消毒劑耐藥基因，是qacE基因的截斷衍生物，由整合子介導，可被革蘭陽性和革蘭陰性菌廣為獲取，其表達產物可使多種化合物排出胞外，賦予細菌對季銨類化合物的耐藥性。sul 1為二氫蝶酸合成酶的編碼基因，陽性提示細菌對磺胺類藥物耐受［8］。本研究顯示，10株多耐藥銅綠假單胞菌qacE△1－sul 1基因攜帶率較高（60%），提示在醫院感染中占重要地位的多耐藥銅綠假單胞菌對季銨類消毒劑已產生耐受性，此類消毒劑用于多耐藥銅綠假單胞菌的感染控制消毒已不合適。

本研究還表明，雖然多耐藥銅綠假單胞菌qacE△1－sul 1基因攜帶率較高，但對該研究中涉及的含氯消毒劑、聚維酮碘、戊二醛沒有表現出抗藥性，低濃度的含氯消毒劑和含碘消毒劑作用1min均能達到滿意效果；而戊二醛相較其他兩種消毒劑作用1min時間的效果稍差，需要延長時間或增加濃度，本研究所試濃度在3min的殺滅率均可達100．00%［9］。因此，在日常工作中應按照消毒劑說明書的使用劑量和使用范圍對醫院感染菌進行消毒，避免濫用及用量不足，科學、合理、有效使用消毒劑，才能確保消毒效果［10］。

［1］ 趙祝香，陳惠玲，趙子文，等．2007～2010年銅綠假單胞菌感染分布及耐藥性變遷分析［J］．檢驗醫學與臨床，2011，8（14）：1667－1668．

［2］ 侯明玖，曾明，侯玲俐，等．多重耐藥鮑曼不動桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究［J］．長江大學學報：自科版醫學卷，2012，9（4）：62－64．

［3］ 徐燕，吳曉松，談智，等．鮑曼不動桿菌抗藥基因檢測及對消毒劑抗性研究［J］．中國消毒學雜志，2008，25（4）：341－343．

［4］ 余琳，江風茹，盧鑒財，等．多重耐藥鮑曼不動桿菌OXA－23基因與qacE△I基因檢測的研究［J］．檢驗醫學與臨床，2011，8（15）：1793－1794．

［5］ 王玉月，史偉峰，朱永華，等．銅綠假單胞菌對5種消毒劑抗性的研究［J］．中華醫院感染學雜志，2008，18（12）：1717－1719．

［6］ 葉慧芬，楊銀梅，陳慧玲，等．2001年廣州地區常見病原菌耐藥性調查［J］．中國抗生素雜志，2002，27（10）：602－605．

［7］ 張玉云，吳金英，范小莉，等．銅綠假單胞菌耐消毒劑基因檢測與對消毒劑抗性研究［J］．實用預防醫學，2008，15（6）：1697－1699．

［8］ 周月清，陸開來．鮑氏不動桿菌耐消毒劑磺胺基因、Ⅰ類整合酶基因及氨基糖苷類修飾酶基因研究［J］．中華醫院感染學雜志，2005，15（7）：728－731．

［9］ 周風蓮，楊莉娜，余陽，等．常用消毒劑對臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌的殺滅效果［J］．中國消毒學雜志，2010，27（3）：250－252．

［10］王震宇．細菌對消毒劑抗性研究進展［J］．中國消毒學雜志，2007，24（2）：169－173．