γ－干擾素釋放試驗在結(jié)核病診斷中的臨床價值

周 政，李建英，韓 飛，王文昕，易興鑫（重慶三峽中心醫(yī)院，重慶萬州 404000）

越來越多的學者開始關(guān)注結(jié)核病的診斷和治療，而結(jié)核分枝桿菌的實驗室檢測和藥敏測定一直是研究的熱點和難點。傳統(tǒng)的檢測方法如結(jié)核菌素皮膚試驗（TST）、抗酸染色涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)鑒定、結(jié)核菌核酸檢測等方法由于其各自的局限性，已逐漸不能完全滿足臨床實驗室的需求，臨床急需一種靈敏度高、特異性高、報告時間短的新方法，用于結(jié)核病患者的診斷和鑒別診斷。隨著免疫學和分子生物學的發(fā)展，一種以T淋巴細胞免疫應答為基礎(chǔ)的γ－干擾素（IFN－γ）釋放試驗（IGRAs）逐漸被人們所認識。IGRAs是一種新的輔助診斷結(jié)核病的方法，它可以定性或定量檢測出機體是否含有結(jié)核分枝桿菌的特異性記憶T細胞，而這種T細胞對于機體是否感染結(jié)核分枝桿菌有著很強的指示性。本文旨在通過比較分析IGRAs、TST、抗酸染色涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)在結(jié)核病患者中的診斷性能，初步評價IGRAs用于結(jié)核病診斷的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1．1 對象 選取2012年1月至2013年8月來本院就診的肺疾病患者，根據(jù)臨床診斷分為肺結(jié)核組：根據(jù)我國《肺結(jié)核診斷標準》（WS288－2008）確診為活動性肺結(jié)核患者32例、非活動性肺結(jié)核患者28例，其中男36例，女24例，年齡15～68歲，平均（32．5±28．4）歲。非結(jié)核肺疾病組：根據(jù)臨床癥狀、體征、X線胸片、CT、肺功能試驗等檢查，確診為肺炎患者18例、慢性阻塞性肺疾病21例、肺氣腫10例、支氣管擴張癥5例，合計54例，其中男32例，女22例，年齡20～75歲，平均（46．3±25．5）歲。健康對照組：35例，均來自于本院健康體檢者，其中男18例，女17例，年齡18～22歲，平均（20．2±1．7）歲。

1．2 實驗方法

1．2．1 結(jié)核菌素皮膚試驗 所有實驗對象均做TST試驗，采用Moutax法，在前臂的掌側(cè)面皮內(nèi)接種0．1mL（含5個結(jié)核菌素單位）標準PPD（購自成都生物制品研究所），72h后檢查反應結(jié)果，測量硬結(jié)直徑。若硬結(jié)直徑大于或等于10mm，則判定為TST試驗陽性。

1．2．2 抗酸染色涂片 肺結(jié)核組患者就診時被告知將做該試驗，取隨機痰、夜間痰和第二日晨痰三個標本，按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第三版）進行涂片、抗酸染色（購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司）和鏡檢。在10×100倍油鏡下至少觀察100個視野，結(jié)核分枝桿菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。按照1984年國內(nèi)統(tǒng)一標準進行報告：全視野（或100個視野）未找到抗酸菌報告“－”；全視野發(fā)現(xiàn)1～2個時報告抗酸菌的個數(shù)；全視野發(fā)現(xiàn)3～9個報告“＋”；全視野發(fā)現(xiàn)10～99個報告“＋＋”；每視野發(fā)現(xiàn)1～9個報告“＋＋＋”；每視野發(fā)現(xiàn)10個以上報告“＋＋＋＋”。

1．2．3 分枝桿菌培養(yǎng) 以肺結(jié)核組患者的晨痰作分枝桿菌培養(yǎng)試驗，采用全自動快速結(jié)核菌培養(yǎng)系統(tǒng)BACTEC MGIT 960（購自美國BD公司）及其配套試劑，嚴格按儀器說明書進行操作。儀器自動判斷報陽，且經(jīng)抗酸染色確認為陽性，即為該標本分枝桿菌培養(yǎng)陽性；若經(jīng)28日培養(yǎng)儀器判斷為陰性，但抗酸染色確認為陽性時，也報告該標本分枝桿菌培養(yǎng)陽性。

1．2．4 IGRAs 所有實驗對象均做IGRAs，在采集全血標本2h內(nèi)進行標本前處理。整個試驗采用酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT），試劑盒購自英國牛津免疫公司，其原理是用結(jié)核分枝桿菌特異性早期分泌靶向抗原6（ESAT－6）和培養(yǎng)過濾蛋白（CFP－10）肽段分別和共同刺激T細胞產(chǎn)生免疫應答，再用ELISPOT法計數(shù)分泌IFN－γ的T淋巴細胞的數(shù)量。試驗嚴格按試劑說明書進行操作。首先用綠頭管（肝素抗凝，BD公司提供）采集受試者4mL靜脈血，在4h內(nèi)分離出外周血單個核細胞（PBMCs），然后用培養(yǎng)液調(diào)整至約2．5×106／mL左右，加入到試劑盒的微孔板內(nèi)。每例標本需要4個微孔板，分別加入培養(yǎng)液（空白對照）、植物血凝集素（陽性對照）、抗原A（ESAT－6）和抗原B（CFP－10），然后于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。第2天取出微孔板，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫，加入堿性磷酸酶標記的γ－干擾素特異性抗體，4℃孵育2h，PBS洗脫，以酶聯(lián)斑點顯色，計數(shù)斑點形成細胞（SFC）。當任一檢測孔達到以下標準即可判定為陽性：（1）空白對照孔的斑點數(shù)小于5個，檢測孔斑點數(shù)減去空白對照孔斑點數(shù)大于或等于6個；（2）空白對照孔的斑點數(shù)大于或等于6個，檢測孔的斑點數(shù)必須大于空白對照孔斑點數(shù)的2倍。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗，檢驗水準α＝0．05。TST和IGRAs的檢測一致性比較采用kappa檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 4 種方法的診斷性能比較 IGRAs對肺結(jié)核病的診斷靈敏度 為 88．3%（53／60），與 TST（66．7%，χ2＝12．85，P＜0．01）、抗酸染色（31．7%，χ2＝25．65，P＜0．01）和分枝桿菌培養(yǎng)（46．7%，χ2＝18．43，P＜0．01）3種方法相比，差異具有統(tǒng)計學意義。而特異性上，IGRAs（89．9%）也高于 TST（75．3%）。因此總體來說，在4種方法中，IGRAs對肺結(jié)核病的診斷性能最高。TST和IGRAs對肺結(jié)核感染一致性比較：結(jié)果見表1。TST和IGRAs對診斷肺結(jié)核的檢測一致性較差，IGRAs的診斷靈敏度和特異性均顯著高于TST。差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

表1 TST和IGRAs對肺結(jié)核感染一致性比較四格表（n）

2．2 IGRAs對活動性肺結(jié)核的診斷性能 見表2。IGRAs對活動性肺結(jié)核的診斷靈敏度（93．8%）顯著高于非活動性肺結(jié)核（82．1%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝5．74，P＜0．05）。

表2 IGRAs對活動性肺結(jié)核的診斷性能表

3 討 論

目前我國結(jié)核病年發(fā)患者數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14．3%，位居全球第2位，僅次于印度。尤其是近年來，結(jié)核病疫情日益惡化，究其原因，一方面是艾滋病、腫瘤等疾病的逐漸增多、器官移植的廣泛開展、高強度免疫抑制劑和大劑量抗腫瘤藥物的使用，導致患者免疫功能逐漸低下，結(jié)核易感性增加；另一方面是耐藥性結(jié)核病患者尤其是耐多藥（MDR）結(jié)核病患者數(shù)量的急劇上升。因此，結(jié)核病的診斷和治療再次成為全球性的醫(yī)療難題。

傳統(tǒng)的結(jié)核菌檢測方法有TST、抗酸染色涂片檢查和分枝桿菌培養(yǎng)等。TST是近一個世紀來應用最廣泛的傳統(tǒng)方法，但TST存在著皮內(nèi)注射風險、觀察結(jié)果需時較長以及給患者帶來不便等缺點，同時因使用純化蛋白衍生物（PPD）在鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌感染與非結(jié)核分枝桿菌感染及卡介苗（BCG）接種方面還存在特異性差的問題。抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的病原學標準，但存在著取樣困難、陽性率低、操作繁瑣、無法區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌（如常見的牛分枝桿菌等）感染等問題。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，包括PCR、基因芯片、探針雜交、DNA測序等在內(nèi)的新興分子學手段也已直接用于結(jié)核病的檢測，但存在著設備昂貴、操作復雜、取樣困難等問題，使其臨床推廣應用具有一定的局限性。因此，臨床迫切需要一種新的診斷性能高、簡便快速的實驗室檢測方法。

隨著免疫學和分子生物學的發(fā)展，IGRAs作為一種具有高潛力的新診斷方法應運而生。IGRAs是利用結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原在體外刺激受檢者全血或外周血單個核細胞，使T淋巴細胞產(chǎn)生大量IFN－γ，然后用酶聯(lián)免疫吸附法或酶聯(lián)免疫斑點法檢測IFN－γ濃度或計數(shù)分泌IFN－γ細胞個數(shù)的方法。IGRAs的代表性試驗有兩種：一種是澳大利亞Cellestis公司的 QuantiFERON－TB Gold（QFT－G）和新一代 QuantiFERONTB Gold In－Tube（QFT－IT）方法，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血淋巴細胞經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后產(chǎn)生的IFN－γ，已分別于2005和2007年被美國FDA批準為結(jié)核篩查試驗；另一種是英國Oxford Immunotech公司的T－SPOT．TB檢測法，主要測量經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原體外刺激后能產(chǎn)生IFN－γ的外周血致敏T淋巴細胞的數(shù)量，在2008年被美國FDA批準作為IGRAs的新方法［1］。T－SPOT使用結(jié)核分枝桿菌特有的片段即缺失區(qū)域（RD）基因編碼的早期分泌靶抗原6和培養(yǎng)過濾蛋白10作為抗原特異性抗原，而QFT－G另外還使用TB7．7抗原［2－3］。由于這些抗原是非結(jié)核分枝桿菌感染和卡介苗接種患者不會產(chǎn)生的，所以IGRAs對于檢測個體對結(jié)核分枝桿菌感染的免疫應答，尤其是非結(jié)核分枝桿菌感染和卡介苗接種患者的特異性高于傳統(tǒng)的TST方法。這兩種技術(shù)在發(fā)達國家均得到很好的利用，特別是在涂片陰性的結(jié)核患者及處于潛伏期的結(jié)核接觸人群的篩選。有相關(guān)系統(tǒng)評價指出，對于處于潛伏期的結(jié)核患者，QFT－IT技術(shù)檢出的靈敏度可以達到70%以上，運用T－SPOT．TB檢出的靈敏度更可高達90%，并且不受疫苗接種的影響。而從特異性角度來說，前者的特異性在未接種疫苗人群特異性高達99%，在接種了疫苗人群中其特異性依舊高達96%；而后者實驗特異性也可達到93%。這些數(shù)據(jù)都提示，這個新的技術(shù)有助于提高結(jié)核的檢出率。

在本研究中，IGRAs對肺結(jié)核病的診斷靈敏度為88．3%（53／60），顯著高于 TST（66．7%）、抗酸染色（31．7%）和分枝桿菌培養(yǎng)（46．7%），而其特異性也顯著高于 TST（89．9%∶75．3%），表明IGRAs對肺結(jié)核病的診斷性能顯著高于TST。而抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)從理論上來說，是結(jié)核病感染的病原學標準，特異性應為100%，但由于非結(jié)核分枝桿菌感染的影響，其特異性也會降低。本實驗由于實驗對象的依從性問題，沒有對非結(jié)核肺疾病組和健康對照組進行該兩項試驗。從表2中可以看出，IGRAs對活動性肺結(jié)核的診斷靈敏度高達93．8%，顯著高于非活動性肺結(jié)核（82．1%）。整個研究結(jié)果與國內(nèi)外學者的結(jié)果相仿［4－8］。Mori等［9］研究表明，在216例有卡介苗接種史而無結(jié)核菌暴露史的健康者中，其全血經(jīng)ESAT6和CFP10共刺激后，僅有4例顯示陽性結(jié)果，特異性為98．1%，而在118例經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)病原學證實的結(jié)核病患者中，有105例出現(xiàn)了陽性結(jié)果，靈敏度達到89%，其靈敏度與本研究相仿，但特異性高于本研究結(jié)果。因此，從國內(nèi)外報道及本研究結(jié)果都可以看出，IGRAs對肺結(jié)核感染具有較高的診斷和鑒別診斷價值，特別是結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌屬感染的鑒別診斷中。Lein等［10］報道，27例肺結(jié)核患者中有16例（59%）可誘導產(chǎn)生高濃度的IFN－γ，而在8例鳥分枝桿菌復合群性肺感染患者中未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。本研究中，由于病例收集的原因，僅對肺結(jié)核患者進行了分析，對肺外結(jié)核感染未涉及，而Chapman等［11］報道證實IGRAs在活動性肺結(jié)核、肺外結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染以及免疫抑制的結(jié)核患者中均可檢出。此外，當結(jié)核分枝桿菌被清除后，致敏T淋巴細胞就會消失，此時檢測致敏T淋巴細胞也可反映出機體是否清除了結(jié)核分枝桿菌，從而進行臨床療效評估［12－13］。

與TST相比，IGRAs的靈敏度高、特異性高，檢測時間較短（24～48h），不需受試者回訪，而且不會激發(fā)記憶性免疫反應等優(yōu)點，因此已越來越多地被臨床用于替代傳統(tǒng)的TST。但同樣需要看到，IGRAs也存在著固有的一些缺點：（1）需要的全血量大，對于嬰幼兒患者很難采集到充足的標本量；（2）標本處理需要及時，一般要求在2h內(nèi)就需要對標本進行前處理；（3）在孵育過程中，可能會觸發(fā)一些免疫功能，如T細胞增殖、細胞因子的產(chǎn)生等，有可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響；（4）IGRAs對于實驗室條件、操作人員、試驗流程等要求較高，且試劑成本高昂，對于臨床的廣泛推廣應用具有一定的局限性。另外，歐洲CDC指南還特別提示，在大多數(shù)臨床情況下，IGRAs陰性并不能完全排除活動性結(jié)核感染。

綜上所述，IGRAs具有靈敏度高、特異性高、檢測時間短、標本易于采集等特點，是一種逐漸替代傳統(tǒng)TST方法的結(jié)核診斷的新的輔助試驗，可用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷、鑒別診斷和療效觀察，但由于其臨床意義的局限性，如何正確使用和判斷結(jié)果必須成為臨床關(guān)注的問題。

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