某國產HIV－1核酸定量檢測試劑盒的應用性能評估

李 梅，王 靜（重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科 400036）

在全球范圍內，獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）病例及其所致的死亡不斷增加，已經成為十大主要死因之一。控制HIV／AIDS流行是目前世界各國面臨的一項十分重要的任務［1］。人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV－1）屬于單股正鏈核糖核酸（RNA）逆轉錄病毒科慢病毒亞科，是艾滋病的主要病原體，主要傳播途徑為性傳播、血液傳播和母嬰傳播。HIV抗體檢測是世界衛生組織和我國衛生部推薦使用的HIV感染診斷方法。細胞培養（病毒分離）、P24抗原檢測、定量核酸檢測（也稱HIV病毒載量檢測）可作為輔助手段使用。定量核酸檢測可測定外周血的病毒含量，相對于其他輔助手段更敏感、便捷，可用于早期HIV－1感染輔助診斷，也廣泛用于研究HIV的感染過程、隨防HIV的疾病進展和藥物療效的評價。

盡管已有HIV－1核酸定量檢測試劑盒獲得國家批文并用于臨床檢驗，但國產試劑盒在檢驗的靈敏度和結果的一致性跟進口試劑仍存在差距，開發高靈敏度和準確性的試劑盒值得深入開展。本研究擬對一種新開發的HIV－1核酸定量檢測試劑盒（PCR－熒光探針法）進行臨床評價，比較其和已被SFDA批準的同類檢測試劑的靈敏度和檢驗結果一致性。

1 材料與方法

1．1 材料 本研究選取了本實驗室收集的不同 HIV感染狀態樣本共247例，其中包括207例HIV－1感染者樣本，干擾組樣本32例，健康者樣本8例。

1．2 試劑與儀器

1．2．1 被評估試劑 為國內正在研制的一種HIV－1核酸定量檢測試劑盒（PCR－熒光探針法，后面簡稱考核試劑），實驗主要儀器有QIAcube全自動核酸純化儀和Rotor－Gene Q實時熒光定量PCR分析儀。檢測線性范圍：5．0×102～1．0×107copy／mL。

1．2．2 對照試劑 為已被SFDA批準并已在臨床試用的該公司生產的“HIV－1核酸定量檢測試劑盒（RT－PCR－熒光探針法）”，檢測線性范圍為5．0×102～1．0×106copy／mL。

1．2．3 復核試劑 為“HIV－1型核酸定量檢測試劑盒（PCR－熒光法）COBAS?AmpliPrep／COBAS?TaqMan?HIV－1Test，version 2．0”（美國 Roche Molecular Systems，Inc，批號：R00002），檢測線性范圍為20～1．0×107HIV RNA copy／mL。

1．3 研究方法 用考核試劑和對照試劑同時檢測血液樣本，比較兩試劑的結果一致性。若檢測結果不符合（陰陽性不符、定量值在線性范圍內且定量結果lg值差大于1的樣本），則該樣本進一步用復核試劑檢測，并以復核檢測結果為標準。所有檢測嚴格按照試劑盒的說明書標準步驟進行。

1．4 統計學方法 采用Excel和SPSS11．0軟件進行統計分析，兩種方法檢測結果的一致性比較采用Kappa檢驗，并計算Youden指數、以1－Specificity的值為橫坐標，以Sensitivity值為縱坐標繪制ROC曲線。使用Bland－Altman模型評價考核試劑與對照試劑定量檢測結果的一致性。檢驗水準α＝0．05。

2 結 果

2．1 考核試劑與對照試劑檢測結果對比 如表1所示，考核試劑與對照試劑檢測結果239例陰陽性一致，8例陰陽性結果不一致：均為考核試劑檢測為陽性、但定量值均低于考核試劑定量線性范圍下限（≤5．0×102copy／mL），而對照試劑檢測為陰性。兩種試劑檢測的陽性符合率為100．00%，陰性符合率為84．62%，陽性預期值PPV為96．06%，陰性預期值NPV為100．00%，一致率為96．76%。

表1 考核試劑與對照試劑盒檢測結果比較（n）

247 例樣本中，除上述8例陰陽性結果不一致外，尚有6例樣本其考核試劑與對照試劑定量結果均處于線性范圍但其對數值差大于1。這14例不符樣本經復核試劑的復檢結果顯示：8例陰陽性不符樣本經復檢后均為陽性，但其病毒量均小于或等于5．0×102copy／mL；6例考核試劑與對照試劑定量檢測結果對數值差大于1的樣本經復核試劑復檢后，定量結果均與復核試劑結果接近，定量結果對數值差小于1。對14例考核試劑與對照試劑不符樣本用復核試劑進一步確認后，考核試劑盒與對照試劑／復核試劑檢測性能比較如下，見表2。考核試劑與復核試劑的陽性符合率、陰性符合率、陽性預期值、陰性預期值和一致率均達到100．00%。

表2 考核試劑與對照試劑／復核試劑結果比較（n）

對247例樣本考核考核試劑盒與對照試劑／復核試劑檢測結果進行統計分析，其Kappa值為1．0、Youden指數為1．0、ROC曲線如圖1所示，ROC曲線下面積為1．0。

圖1 考核試劑檢測結果的ROC曲線

2．2 定量相關性、定量準確性及一致性 選擇考核試劑盒與對照試劑定量線性范圍內（不剔除高于定量范圍上限樣本）177例樣本檢測結果進行定量相關性、定量準確性及一致性統計分析。統計分析表明，考核試劑與對照試劑／復核試劑的相關系數為：r＝0．967 1（P＜0．05，圖2）。以考核試劑與對照試劑定量值對數值均值為橫坐標、差值為縱坐標做散點圖（經復核樣本用復核試劑檢測結果為標準進行統計分析），結果見圖3。Bland－Altman模型顯示其一致性界限LoA及其95%置信區間為：－0．481（－0．513 ～ －0．449）～ 0．501（0．469～0．533）；經統計95%的差值位于一致性界限以內，且LoA不超過專業上可接受的界限值：1lg。

圖2 考核試劑與對照試劑／復核試劑定量相關性

圖3 考核試劑盒Bland－Altman模式一致性分析圖

3 討 論

艾滋病作為一種嚴重危害人類健康的疾病，目前尚無有效的預防性疫苗，因此，其防控尤為重要［2］。其病原體HIV感染的相關檢測主要包括HIV抗體檢測、HIV抗原檢測、HIV核酸檢測、HIV－1耐藥性檢測、CD4＋／CD8＋淋巴細胞檢測等［3］。對HIV感染者及艾滋病患者進行HIV病毒載量檢測是評價疾病進展、確定治療開始時間、監測高效抗反轉錄病毒治療療效的重要指標，在嬰兒早期診斷及感染窗口期診斷中具有重要的輔助診斷價值［4］。病毒載量定點水平大于或等于104copy／mL者快速發展為艾滋病的危險性增加10．8倍［5］。

本次研究共檢測247例樣本，233例考核試劑與對照試劑檢測結果一致、14例檢測結果不一致者經復核試劑檢測確認后，均與考核試劑檢測結果一致，顯示考核試劑具有較好的檢測敏感性和準確性，檢測性能優于對照試劑，可接近進口的國際公認試劑的水平。本研究表明，艾滋病患者樣本定性和定量檢測結果的不一致時，應考慮不同種試劑的有效定量檢測范圍和其檢測靈敏度。有報道表明，經過抗病毒治療2～8周后，艾滋病患者樣本血漿中病毒載量降低約10倍，16～24周后會降低到測不出的程度［6－7］。在病毒載量較低時，不同試劑盒加樣量的不同會直接導致檢測敏感性的差異［8］。對治療后病毒量較低或者檢測不出的標本，應結合臨床采用各種檢測手段監測。

經臨床研究表明，被評估的HIV－1核酸定量檢測試劑盒（PCR－熒光探針法）與已經上市的國內外同類產品在人血漿或血清樣本中的HIV－1RNA的定量測定功能上具有等效性，可用于人類免疫缺陷病毒的早期診斷、疑難樣本的輔助診斷、艾滋病的病程監控及預測、以及指導抗病毒治療及療效判定。

［1］尚紅．中國艾滋病流行和檢測及治療現狀與發展趨勢［J］．中華檢驗醫學雜志，2008，31（10）：1088－1090．

［2］ 張宏萍．三種方法篩查HIV抗體的比較［J］．上海預防醫學，2012，24（3）：155－159．

［3］ 董雪，趙曦，里天初，等．中國三版艾滋病檢測技術工作規范的對比分析［J］．中國艾滋病性病，2010，16（6）：595－598．

［4］ 彭巧麗，李美忠，蔣強，等．不同HIV－1病毒載量定量檢測方法的比較研究［J］．中國艾滋病性病，2011，17（1）：4－7．

［5］ 李敬云．HIV早期感染診斷方法與應用［J］．傳染病信息，2007，20（6）：352－356．

［6］ 王夏，唐力，劉滿清，等．武漢市艾滋病患者高效抗逆轉錄病毒治療效果分析［J］．中華疾病控制雜志，2010，14（3）：212－214．

［7］ 彭瑾瑜，賀建梅，鄒瀟白，等．接受抗病毒藥物治療艾滋病患者體內病毒數量變化研究［J］．中實用預防醫學，2010，17（4）：644－646．

［8］ 李繁，蔣巖，王天怡，等．某種人類免疫缺陷病毒Ⅰ型核酸定量檢測試劑盒的性能評估［J］．中華疾病控制雜志，2013，17（7）：605－608．