雙黃痛風膠囊質量標準提高研究

陳玉棠，黃藝蓉，成金樂，梁燕玲，陳金梅

(1.廣州中醫藥大學 中藥資源科學與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006； 2.中山市中智藥業集團有限公司，廣東 中山 528437)

雙黃痛風膠囊質量標準提高研究

陳玉棠1，2，黃藝蓉1，2，成金樂2*，梁燕玲2，陳金梅2

(1.廣州中醫藥大學 中藥資源科學與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006； 2.中山市中智藥業集團有限公司，廣東 中山 528437)

目的補充優化雙黃痛風膠囊的薄層鑒別及含量測定方法，提高其質量標準。方法采用薄層色譜法(TLC)對處方中赤芍、黃芪、秦皮進行定性鑒別；用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定黃芪甲苷的含量。色譜條件：Agilent Zobax C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-水(32∶68)；蒸發光散射檢測器(ELSD)。結果薄層鑒別方法專屬性強；HPLC法測得黃芪甲苷在1.123～6.741 μg(r=0.999 9)線性關系良好，平均回收率為99.75%，RSD=1.75%。結論提高后的標準方法簡便可行，專屬性強，重復性好，可更好地控制雙黃痛風膠囊的質量。

雙黃痛風膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜-蒸發光散射檢測法；黃芪甲苷；質量標準

雙黃痛風膠囊是正在研制開發的中藥第6類新藥，由黃芪、秦皮、赤芍、黃柏、茶葉組成，具有益氣活血、清熱利濕的功效，用于氣虛血瘀兼濕毒瘀阻型高尿酸血癥。黃芪甲苷為本方君藥黃芪的主要活性成分，具有抗心力衰竭、保護心血管、降壓、鎮痛、調節血液尿酸代謝等作用[1-2]。雙黃痛風膠囊原質量標準草案中，鑒別項僅對茶葉所含的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)進行薄層鑒別，未對處方中其他藥味進行鑒別；含量測定項對黃芪甲苷的檢測采用操作繁雜、重復性較差的薄層色譜掃描法，結果準確度不高。實驗通過研究，在雙黃痛風膠囊原標準的基礎上，增加了對赤芍、黃芪和秦皮的薄層色譜鑒別，并改用HPLC方法對黃芪甲苷進行含量測定，提高了雙黃痛風膠囊的質量標準，可更好地控制產品的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀(G4218A的ELSD蒸發光檢測器)；Agilent Chemstation色譜工作站；AUW220D十萬分之一電子天平(島津公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司);KQ-400KOE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷(批號：110781-200613)、芍藥苷(批號：110736-201136)、秦皮甲素(批號：110740-200104)、秦皮乙素(批號：110741-200506)、黃芪對照藥材(批號：120974-201110)、赤芍對照藥材(批號：121093-200402)、秦皮對照藥材(批號：121415-200702),均購自中國食品藥品檢定研究院；雙黃痛風膠囊(批號：110801，210301，310301)、陰性對照品由中山市中智藥業集團有限公司提供；乙腈為色譜純；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 赤芍[3]

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品內容物約3 g，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解；用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 mL，棄去氨液，取正丁醇液30 mL水浴蒸干(剩余30 mL，用于黃芪薄層鑒別供試品的制備)，殘渣加乙醇1 mL使溶解，即可。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 另取芍藥苷對照品適量，加乙醇制成2 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.1.3 對照藥材溶液的制備 取赤芍對照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，即可。

2.1.1.4 陰性樣品溶液的制備 取不含赤芍的陰性樣品，按“供試品溶液制備方法”制成陰性樣品溶液。

2.1.1.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4]，吸取上述4種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，見圖1。

1.芍藥苷對照品 2.赤芍對照藥材 3.缺赤芍陰性樣品 4～6.供試品(批號：110801，210301，310301)圖1 雙黃痛風膠囊中赤芍TLC圖

2.1.2 黃芪[4，5]

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取2.1.1赤芍供試品溶液制備項下剩余的30 mL正丁醇液，蒸干；殘渣加水5 mL微熱使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑為1.5 cm，柱高為12 cm)依次以50 mL水、30 mL40%乙醇、50 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇的洗脫液，蒸干；用甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即可。

2.1.2.2對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制得1 mg·mL-1的黃芪甲苷對照品溶液，置于4 ℃保存。

2.1.2.3 對照藥材溶液的制備 取黃芪對照藥材1 g，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目，5 g，內徑10～15 mm)上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干；殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用水萃取2次，每次20 mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即可。

2.1.2.4 陰性樣品溶液 取不含黃芪的陰性樣品，按2.1.2.1項下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.1.2.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4]，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10 ℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

1.黃芪甲苷對照品 2.黃芪對照藥材；3.缺黃芪陰性樣品 4～6.供試品(批號：110801，210301，310301)圖2 雙黃痛風膠囊中黃芪TLC圖

2.1.3 秦皮

2.1.3.1供試品溶液的制備 取本品內容物約3 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇40 mL，加熱回流2次，每次30 min，濾過，濾液濃縮至稠膏，加水20 mL溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，濃縮至稠膏。濃縮液加乙醇5 mL溶解，加到聚酰胺柱(內徑10～15 mm，柱高15 cm)，水洗脫至無顏色，蒸干。用乙醇溶解定容到2 mL量瓶中。

2.1.3.2 對照品溶液制備 取秦皮甲素對照品和秦皮乙素對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液。

2.1.3.3 對照藥材溶液的制備 取秦皮對照藥材1 g，加甲醇10 mL，加熱回流10 min，放冷，濾過，取濾液。

2.1.3.4 陰性樣品溶液制備 取不含秦皮的陰性樣品，按2.1.3.1項下供試品溶液制備方法制備。

2.1.3.5 TLC鑒別 按照薄層色譜法[4](《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述8種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(10∶2.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，在365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照樣品無干擾。

1.秦皮甲素對照品 2.秦皮乙素對照品 3.混合對照品 4.缺秦皮陰性樣品 5.秦皮對照藥材 6～8.供試品(批號：110801，210301，310301)圖3 雙黃痛風膠囊中秦皮TLC圖

2.2 黃芪甲苷的含量測定[6-9]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobax C18(250 mm×4.6mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；ELSD蒸發光散射檢測器參數：漂移管溫度40 ℃，載氣(氮氣)壓力3.5 Bar。理論板數按黃芪甲苷峰計算不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.1 mg·mL-1的對照品溶液，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下本品內容物研細，取約0.75 g，精密稱定，精密移取80%甲醇50 mL于具塞錐形瓶中，稱定；超聲處理45 min(功率320 W，頻率4 kHz)，放冷，用甲醇補足損失量，濾過，濾液蒸干。殘渣加水15 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液；正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芪的陰性對照樣品，照2.2.3項下供試品溶液的制備制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取上述3種溶液各20 μL，分別注入色譜儀，按其色譜條件測定，結果見圖3。供試品溶液和對照品溶液在相應保留時間出現相似峰，分離度良好，而陰性樣品溶液在黃芪甲苷色譜峰相應的保留時間處無干擾，黃芪甲苷峰與其他組分達到基線分離。

A.黃芪甲苷對照品 B.供試品 C.缺黃芪陰性樣品圖3 雙黃痛風膠囊及對照品HPLC圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密移取黃芪甲苷對照品溶液(0.5 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，分別吸取續濾液20 μL注入液相色譜儀測定，以進樣量的自然對數為橫坐標，峰面積的自然對數為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=1.611 3X+5.094 5，r=0.999 9。黃芪甲苷在1.123～6.741 μg與峰面積對數值呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液20 μL，重復進樣6次，依法測得黃芪甲苷峰面積對數的RSD=0.01%，說明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別在0，2，4，6，8，10，24 h依法測定，得黃芪甲苷峰面積對數的RSD=0.13%(n=7)，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.9 重復性試驗 分別取同一批樣品(批號：310301)5份，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣20 μL，依法測定，結果黃芪甲苷含量的RSD=0.03%，表明方法重現性好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品(批號：310301)6份，每份約1 g，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液(即0.5 mg·mL-1)0.8，0.9，1.0 mL，按2.2.3項下方法配制供試品溶液，依法測定，進樣量為20 μL，記錄色譜峰，計算回收率及其RSD值，見表1。

表1 雙黃痛風膠囊中黃芪甲苷加樣回收率試驗

2.2.11 樣品含量測定 分別取不同批號樣品，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，每批取3份，依法測定，結果見表2。

表2 雙黃痛風膠囊中黃芪甲苷含量測定

2.2.12 最低檢測限試驗 精密移取黃芪甲苷對照品溶液(1.123 mg·mL-1)1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取3 μL，注入高效液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件測定，采用信噪比法，測得色譜圖中信噪比為3.2，因此黃芪甲苷的檢測限為168 ng。

3 討論

在赤芍的薄層鑒別中，本法制備的供試品溶液，所得的薄層色譜背景雜質干擾小，斑點清晰。同時，該供試品溶液制備方法亦用作黃芪薄層鑒別項供試品前處理的制備，可大大簡化操作步驟，提高實驗效率。本實驗也考察了乙酸乙酯-冰醋酸-水(8∶2∶1)[10]、三氯甲烷-甲醇(5∶1)[11]等不同的展開劑系統，但展開效果不佳，而本文采用的展開系統分離效果好、斑點清晰。

秦皮的薄層鑒別中，曾參考《中國藥典》2010年版秦皮藥材的供試品制備方法，但受到其他物質的嚴重干擾，無法顯現斑點，經過摸索，本實驗的方法經提取純化后能排除雜質的干擾，更適合本制劑的薄層鑒別。同時也考察不同展開系統，結果存在陰性干擾或與對照品色譜相應的位置上，未顯相同顏色的斑點。本展開系統是根據《中國藥典》方法通過調整得出的，斑點分離得好，不受雜質干擾。

在黃芪甲苷的含量測定項中，供試品溶液的制備分別考察了不同提取方法(索氏提取和超聲提取方法)、不同提取溶劑(水、50%甲醇、80%甲醇、2%氫氧化鉀甲醇溶液)對黃芪甲苷含量的影響，結果表明以80%甲醇作溶媒超聲提取效果最佳，而2%氫氧化鉀甲醇溶液提取黃芪甲苷含量雖高，但長時間處在堿性條件下，可能會導致成分發生變化，故不選用。本實驗還考察了不同提取時間(30，45，60 min)和不同純化方法(過大孔樹脂柱和不過樹脂柱)對黃芪甲苷含量影響，結果超聲45 min和不過大孔樹脂柱方法的效果為佳。

實驗選用ELSD檢測器，能克服DAD檢測器對皂苷類成分紫外末端吸收弱的缺點，更好地用于皂苷類成分的檢測。

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StudiesonImprovingQualityStandardofShuanghuangTongfengCapsules

CHENYutang1，2，HUANGYirong1，2，CHENGJinle2*，LIANGYanling2，CHENJinmei2

(1.ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan(GuangzhouUniversityofChineseMedicine)，MinistryofEducation，Guangzhou510006，China； 2.ZhongshanZeusPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Zhongshan528437，China))

Objective：To impove the quality standard of Shuanghuang Tongfeng Capsules.MethodsThe TLC method was used to identifyPaenoiaeRadixRubra，AstragaliRadixandFraxiniCortex.The study of HPLC-ELSD methodology was carried out to determine the content of Astragaloside Ⅳ in the capsules.Chromatography method was performed on an Agilent Zobax ODS column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，the mobile phase composition was acetonitrile-water(32∶68).ResultsThis method is good in separation，strong in specificity.The linear range of Astrogaloside Ⅳ was 1.123-6.741 μg(r=0.999 9).The average recovery rate was 99.75%，RSD1.75%.ConclusionThe method is simple，feasible and reproducible.It can be used for the quality control of Shuanghuang Tongfeng Capsules.

Shuanghuang Tongfeng Capsules；TLC；HPLC-ELSD；Astrogaloside Ⅳ；Quality

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成金樂，主任中藥師，研究方向：創新中藥開發；Tel：(0760)85312928，E-mail：gdcjl9@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.015

2013-09-12)

standard