非轉移性黑色素瘤糖蛋白B在增生性玻璃體視網膜病變及視網膜色素上皮細胞中的作用

司艷芳 樊旭 關娟 周歷 趙娟

增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是裂孔源性視網膜脫離手術失敗常見的原因［1］。在 PVR膜的細胞成分中最重要的細胞之一是視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞。研究發現，RPE細胞的增生與PVR發病機制相關［2-5］。非轉移性黑色素瘤糖蛋白 B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白［6］，廣泛表達于多種組織［7］。研究表明GPNMB與多種疾病的生理、病理過程相關［8］。但尚未有文獻報道GPNMB對RPE細胞生物學功能的影響。因此，本研究采用免疫熒光、酶聯免疫吸附試驗、MTT等方法，檢測GPNMB在不同病變程度PVR中的定量表達以及GPNMB對RPE細胞增殖、細胞周期的影響，擬在探討GPNMB在PVR病變中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集解放軍309醫院在2012年1月至12月確診的18例PVR患者的視網膜表面增生膜。患者年齡15～60歲。PVR病變程度分級標準參照1991年美國視網膜學會的分級方法，分為A、B、C 3級。

1.2 主要儀器及試劑 CO2細胞培養箱(Binder公司，德國)，酶聯免疫檢測儀(Sheldon公司，美國)，流式細胞儀(Olympus，日本)，激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad公司，美國)。限制性內切酶 EcoRI、XhoI，T4連接酶，RNA 酶，胰蛋白酶(Takara，大連)，LipofectamineTMRNAiMAX，載體 pMD19-T、pcDNA3.1(+)(Invitrogen，美國)，抗 GPNMB抗體、抗生物素標記的Texas Red、FITC標記的膜聯蛋白(Abcam，美國)，M254 培養基、G418、MTT、碘化吡啶(GIBCO BRL，美國)。

1.3 引物及 siRNA GPNMB-P1:5’-AACCTTGAGTGCCTGCGTC-3’，GPNMB-P2:5’-ACTT-CCCCAAACCACAATATCTA-3’;GPNMB-P3:5’-CCGGAATTCATGGAATGTCTCTACTATTTCCTGGGAT-3’，含 EcoRI酶切位點;GPNMB-P4:5’-CCGCTCGAGTCATTAAGAAACTCCTTTAAATTCTTG-3’，含 XhoI酶切位點。靶向 GPNMB的 siRNA序列:GPNMB(sense:5’-GGGCAAUGAAAGACCUUCUTT-3’，antisense:5’-AGAAGGUCUUUCAUUGCCCTT-3’)。所有引物均由上海生工合成。

1.4 方法

1.4.1 免疫熒光 石蠟標本常規脫蠟，進行如下操作:滴加正常羊血清(1∶50稀釋)，室溫溫育 30 min;漂洗后與抗 GPNMB(1∶50稀釋)一抗于4℃孵育過夜;漂洗后與生物素標記的二抗(1∶50稀釋)在37℃溫育30 min;最后滴加抗生物素標記的Texas Red(1∶1000稀釋)，于37℃放置30 min。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后用甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并進行定量分析。……