維生素D及其受體對RIP1調(diào)控作用的研究

（中國醫(yī)科大學代謝病分子機制與藥物研究所，沈陽 110001）

維生素D及其受體對RIP1調(diào)控作用的研究

劉兵，葛鑫，丁炎，陳允梓，聶宏光

（中國醫(yī)科大學代謝病分子機制與藥物研究所，沈陽 110001）

目的探討維生素D及其受體對受體相互作用蛋白（RIP）1表達的影響及其作用機制。方法采用實時定量PCR和Western blot技術，檢測維生素D刺激對RIP1的mRNA和蛋白表達水平的影響，采用免疫共沉淀的方法探討維生素D及其受體對RIP1的調(diào)節(jié)機制。結果維生素D及其受體能夠顯著降低RIP1的mRNA及蛋白水平表達，抑制HSP90與RIP1復合物的形成。結論維生素D及其受體通過調(diào)節(jié)HSP90與RIP1的相互作用調(diào)控RIP1的表達，為維生素D及其受體抑制腫瘤的發(fā)生提供了新的理論依據(jù)。

維生素D；維生素D受體；受體相互作用蛋白；熱休克蛋白

受體相互作用蛋白（receptor interacting protein，RIP）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以調(diào)節(jié)核因子κB的活性，是壞死信號通路中關鍵的調(diào)控因子，決定細胞生存和死亡的交叉點［1，2］。目前發(fā)現(xiàn)，RIP家族成員RIP1在細胞凋亡、細胞存活及細胞程序性壞死等信號傳導中起著關鍵的作用［3］，而其功能受熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），泛素化等的調(diào)節(jié)［4］。維生素D（lα，25-dihydroxyvitamin D3）可以影響多種轉(zhuǎn)錄因子的信號通路，目前已有相當多的流行病學研究結果表明，體內(nèi)維生素D水平與惡性腫瘤的發(fā)生或預后呈負相關［5］。維生素D具有抑制腫瘤等生物學功能，但其具體機制尚不明確。本研究通過檢測維生素D刺激對RIP1的mRNA和蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)維生素D可以抑制RIP1的表達。進一步的研究表明此作用可能與其抑制HSP90和RIP1復合物的形成有關，這一發(fā)現(xiàn)將為維生素D及其受體抑制腫瘤的發(fā)生提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細胞株（mice embryonic fibroblasts cells，MEFS）以及VDR-/-MEFS來自美國芝加哥大學Yanchun Li實驗室，小鼠成纖維細胞株（mouse fibroblasts cells，L929）購自American Type Culture Collection（ATCC）公司。

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司；胰酶和胎牛血清，購自美國Cellgro公司；Trizol，購自美國Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒，購自日本TaKaRa公司；維生素D、格爾德霉素來自美國芝加哥大學Yanchun Li實驗室；兔抗人RIP1單克隆抗體購于美國Sigma公司；IgG-HSP90、小鼠抗VDR單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，均購自美國Santa Cruz公司；ECL發(fā)光液購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：MEFS細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/mL）、鏈霉素（100 μg/μL）的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、含有5%CO2+95%O2的濕化氣體中孵育貼壁生長傳代，每2 d傳代1次，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2 實時定量PCR檢測不同處理組MEFS細胞中mRNA變化：用20 nmol/L維生素D，20 ng/μL腫瘤壞死因子α分別于0、12、24、48、72、96 h 6個時間點處理MEFS細胞，以觀察維生素D對其誘導的死亡作用影響。用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA。紫外分光光度法進行準確定量，取500 ng進行逆轉(zhuǎn)錄，最后用實時定量PCR儀檢測細胞中RIP1的表達量。內(nèi)參采用GAPDH，RIP1特異寡核苷酸引物為：Forward：5′-AGTCCTGGTTTGCTCCTTCCC-3′；Reverse：5′-GCGTCTCCTTTCCTCCTCTCTG-3′。反應條件為95℃預變性5 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40個循環(huán)。結果采用比較閾值法進行定量分析。對每一標本計算目的基因的拷貝數(shù)并比較。

1.2.3 Western blot檢測不同處理組細胞中RIP1蛋白表達的變化：用20 nmol/L維生素D按照不同時間點處理細胞，蛋白裂解法提取蛋白，加熱變性后應用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗為1∶1 000稀釋的兔抗人RIP1或β-actin。4℃孵育過夜后用TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，1∶2 000稀釋。室溫孵育1 h，TBST洗膜后與ECL試劑反應。X線片曝光，顯影，定影后分析。

1.2.4 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，IP）：細胞在非變性條件下被裂解，完整細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留。預冷的RIP1A Buffer，protein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有IgG的溶液及RIP1抗體反應后，其上的protein A就能吸附抗原。4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜。加入100 μL Protein A beads來捕捉抗原抗體復合物，混合，離心。收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIP1A buffer清洗。將上樣樣品煮5 min，以游離抗原、抗體、珠子，離心，將上清電泳，電泳前應再次煮5 min變性，進行Western分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 維生素D對MEFS和L929細胞中RIP1 mRNA表達水平的影響

圖1 Real-time PCR檢測不同維生素D處理組細胞RIP1m RNA水平的表達Fig.1 Expression levels of RIP1 mRNA with different vitamin D treatment groups by real-time PCR

實時定量PCR結果（圖1）顯示，隨著維生素D（20 nmol/L）誘導時間的增加，RIP1mRNA的表達水平都有所下降。在L929細胞中，4 h抑制效果最明顯。并且與0 h RIP1表達水平相比存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05，n=3）（圖1A）。在MEFS細胞中，24 h抑制效果最明顯。以0 h RIP1表達水平為100%，12、24、48 h時間點mRNA水平與對照組相比均有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05，n=3）（圖1B）。維生素D長時間刺激后，細胞中RIP1mRNA的表達水平呈上升趨勢，可能與溶液中維生素D隨時間延長而代謝增多，對細胞中RIP1 mRNA的表達抑制能力減弱有關。在VDR敲除的MEFS（VDR-/-）細胞中，RIP1 mRNA的表達水平明顯高于野生型（WT）細胞，進一步證實維生素D及其受體對RIP1 mRNA的表達有抑制作用（圖1C）。

2.2 維生素D對MEFS和L929細胞中RIP1蛋白表達水平的影響

Western blot結果表明，在L929細胞中，維生素D（20 nmol/L）迅速降低RIP1蛋白表達，2 h最為顯著（圖2A）。在野生型MEFS細胞中，給予維生素D（20 nmol/L）預處理2 h后，對RIP1的抑制作用與L929細胞相似；而在VDR敲除的MEFS（VDR-/-）細胞中，RIP1蛋白表達水平明顯高于野生型（WT）細胞，進一步證實維生素D及其受體對RIP1的蛋白表達有抑制作用（圖2B）。

圖2 Western blot檢測不同細胞系RIP1蛋白水平的表達Fig.2 Expression of RIP1 protein in different stable cell lines by Western blot

2.3 維生素D對RIP1與HSP90相互作用的調(diào)控

為探索維生素D調(diào)控RIP1表達的作用機制，本研究采用免疫共沉淀方法檢測了RIP1與HSP90的相互作用。結果顯示，維生素D（20 nmol/L，2 h）預處理的MEFS細胞中，HSP90與RIP1結合條帶明顯弱于對照組，說明維生素D的刺激抑制了HSP90-RIP1復合物的形成（圖3A）。進一步的實驗結果顯示，隨著格爾德霉素（geldanamycin，GA）（HSP90的特異性功能抑制劑）不同劑量預刺激2 h后，RIP1的表達量呈現(xiàn)劑量依賴的下降；并且VDR缺失的MEFS細胞中給RIP1的表達量下降更加顯著，表明維生素D受體的缺失促進了GA破壞HSP90-RIP1復合物的穩(wěn)定性（圖3B）。

3 討論

圖3 維生素D及其受體對RIP1和HSP90的相互作用的影響Fig.3 Detection of vitamin D and its receptor for RIP1 and HSP90 interaction.

RIP1是腫瘤壞死因子α信號通路的重要組成部分，通過非降解的泛素鏈快速且穩(wěn)定地募集腫瘤壞死因子受體。腫瘤壞死因子α依賴RIP1激活核因子κB［6］。核因子κB是促細胞存活的重要信號效應分子，調(diào)控細胞生長、存活、組織和器官發(fā)育以及系統(tǒng)的免疫反應等，與多種人類疾病密切相關［7］。核因子κB的持續(xù)活化是腫瘤細胞生長的重要原因［8］。缺乏RIP1的細胞對腫瘤壞死因子α誘導的死亡高度敏感，可能與缺乏RIP1而不能激活存活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB有關。因此，RIP1與腫瘤的發(fā)生密切相關。臨床研究表明，較低的維生素D水平是導致多種癌癥發(fā)生的重要因素，維生素D能夠降低多種癌癥的死亡率［9］，如結腸癌、直腸癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等。維生素D抑制腫瘤的機制尚不清楚，我們推測維生素D的上述作用可能與RIP1相關。

在本研究中我們應用不同細胞株檢測了維生素D對RIP1mRNA及蛋白表達水平的影響，結果顯示維生素D及其受體能夠顯著降低研究凋亡經(jīng)典細胞系MEFS中RIP1 mRNA及蛋白水平表達，其他細胞系如小鼠成纖維細胞L929，人結腸癌細胞HT-29，人乳腺癌細胞MCF-7等，作用均與其相似，即維生素D及其受體對RIP1的表達具有抑制作用。

HSP是包括RIP1在內(nèi)的很多蛋白激酶的伴侶蛋白，HSP的主要作用是參與已獲得三級結構的蛋白質(zhì)的激活與成熟過程［10］。根據(jù)同源程度和分子量的大小，可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素等幾個家族，其中，HSP90在多種腫瘤組織中表達較高，與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中的信號蛋白相互作用，維持這些蛋白的正常結構與功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11］。HSP90可以和RIP1形成復合物，穩(wěn)定RIP1，使其避免被溶酶體降解。在本研究進一步探討維生素D及其受體對RIP1的表達具有抑制作用的機制過程中，我們發(fā)現(xiàn)維生素D可以抑制HSP90與RIP1的結合。格爾德霉素屬于苯醌安莎霉素類抗生素，作為HSP90的特異性功能抑制劑，會導致RIP1的降解，破壞HSP90與RIP1的相互作用［12］，我們的研究表明在VDR缺失的細胞中這種降解作用更顯著，進一步證實VDR可能參與了HSP90與RIP1的相互作用。

本研究結果揭示維生素D及其受體對RIP1的表達具有下調(diào)作用，并且表明其作用機制與影響HSP90與RIP1的相互作用有關。這將為我們深入了解維生素D及其受體對腫瘤的作用機制提供新的思路，對于某些惡性腫瘤應用維生素D進行選擇性的誘導腫瘤細胞程序性死亡可能起到潛在的治療效果。

［1］Christofferson DE，Li Y，Hitomi J，et al.A novel role for RIP1 kinase in mediating TNFα production［J］.Cell Death Dis，2012，3：e320.

［2］Galluzzi L，Kepp O，Kroemer G，et al.RIP kinases initiate programmed necrosis［J］.J Mol Cell Biol，2009，1（1）：8-10.

［3］O′Donnell MA，Ting AT.RIP1 comes back to life as a cell death regulator in TNFR1 signaling［J］.FEBS J，2011，278（6）：877-887.

［4］Meylan E，Burns K，Hofmann K，et al.RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3-induced NF-kappa B activation［J］.Nat Immunol，2004，5（5）：503-507.

［5］Wang Y，Zhu J，DeLuca HF.Where is the vitamin D receptor?［J］Arch Biochem Biophys，2012，523（1）：123-133.

［6］Festjens N，Vanden Berghe T，Cornelis S，et al.RIP1，a kinase on the crossroads of a cell′s decision to live or die［J］.Cell Death Dif-fer，2007，14（3）：400-410.

［7］Sun SC，Liu ZG.A special issue on NF-κB signaling and function［J］.Cell Res，2011，21（1）：1-2.

［8］Peterlik M，Grant WB，Cross HS.Calcium，vitamin D and cancer［J］.Anticancer Res，2009，29（9）：3687-3698.

［9］Wajant H，Scheurich P.TNFR1-induced activation of the classical NF-κB pathway［J］.FEBS J，2011，278（6）：862-876.

［10］Lin Y，Devin A，Rodriguez Y，et al.Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis［J］. Genes Dev，1999，13（19）：2514-2526.

［11］Ea CK，Deng L，Xia ZP，et al.Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO［J］.Mol Cell，2006，22（2）：245-257.

［12］Lewis J，Devin A，Miller A，et al.Disruption of hsp90 function results in degradation of the death domain kinase，receptor-interacting protein（RIP），and blockage of tumor necrosis factor-induced nuclear factor-kappaB activation［J］.J Biol Chem，2000，275（14）：10519-10526.

（編輯裘孝琦）

Study on the Regulation ofRIP1 by Vitamin Dand Vitamin DReceptor

LIU Bing，GEXin，DINGYan，CHENYun-zi，NIE Hong-guang
（Institute ofMetabolic Disease Research and Drug Development，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveReceptor Interacting Protein（RIP）is a crucial regulator in the signaling pathway of necrosis.This study aimed to investigate the effects of vitamin D and vitamin D receptor on the expression of RIP1 and to explore the underlying mechanism.MethodsThe expression levels of RIP1mRNA and protein were detected by real-time quantitative PCR and Western blot.Then the co-immunoprecipitation assay was performed to detect the interaction between vitamin D，vitamin D receptor and RIP1.ResultsVitamin D and Vitamin D receptor significantly reduced the transcription and expression levels of RIP1，and repressed the formation of the HSP90 and RIP1 complex.ConclusionVitamin D and vitamin D receptor could regulate the expression of RIP1 by regulating the interactions between HSP90 and RIP1，which provides a new theoretical basis for suppression ofthe occurrence oftumors by vitamin Dand itsreceptor.

vitamin D；vitamin D receptor；receptor interacting protein；heat-shock protein

Q255

A

0258-4646（2015）04-0289-04

國家自然科學基金（81270098；81371759）

劉兵（1990-），女，碩士研究生.

聶宏光，E-mail：niehg@hotmail.com

2014-10-17

網(wǎng)絡出版時間：