microRNA let-7a對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控及其在白內障中的作用

秦宇，趙江月，閔曉潔，羅文婷2，李晶，吳欣蔚，劉佳，閻啟昌，張勁松

（1.中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心，沈陽 110004）

microRNA let-7a對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控及其在白內障中的作用

秦宇1，趙江月1，閔曉潔1，羅文婷2，李晶1，吳欣蔚1，劉佳1，閻啟昌1，張勁松1

（1.中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心，沈陽 110004）

目的探討microRNA let-7a對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控作用及其在白內障中的作用。方法利用Real time q-PCR方法，檢測年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜和正常人眼晶狀體前囊膜、人晶狀體上皮細胞凋亡模型和正常人晶狀體上皮細胞系let-7a的表達情況；利用Lipofectamine 2000瞬時轉染let-7a mimic和let-7a inhibitor，分別上調和下調人晶狀體上皮細胞中let-7a的表達，并利用Real time q-PCR方法驗證轉染效率，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。結果年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜組let-7a的表達顯著低于正常對照組；人晶狀體上皮細胞凋亡模型組let-7a的表達顯著低于正常對照組；let-7a mimic轉染組let-7a的表達顯著高于對照組，let-7a inhibitor轉染組let-7a的表達顯著低于對照組；let-7a mimic轉染組細胞凋亡率顯著低于對照組，let-7a inhibitor轉染組細胞凋亡率顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論microRNA let-7a能夠調控人晶狀體上皮細胞凋亡，從而在白內障發病過程中發揮重要作用，microRNA let-7a可能成為白內障非手術治療的新靶點。

microRNA；let-7a；細胞凋亡；白內障

隨著人口老齡化問題日趨嚴重，作為世界范圍內首位致盲眼病，白內障的發病率迅速上升，不僅嚴重損害老年人的視力，同時嚴重影響老年人的生活質量。盡管目前針對白內障最有效的治療方法仍然是手術，但是存在患者對手術的恐懼心理、術后調節能力重建與后發性白內障等一系列問題，手術治療的巨大醫療支出也給我國衛生資源和社會經濟帶來了沉重負擔。因此，探索白內障非手術治療的新途徑勢在必行。近年來，微小RNA（micro-RNA，miRNA，miR）的發現為白內障非手術治療研究帶來了新希望。

microRNA是一類長約21～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA［1］，通過與mRNA的3’非翻譯區序列完全或不完全互補配對，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制［2］，在轉錄后水平影響發育、增殖、分化、凋亡等過程中組織特異性基因的表達［3，4］，從而調控著人類整個基因組中大約1/3基因的表達［5］。有文獻報道，microRNA在白內障發病過程中發揮著重要的調控作用，其中，對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控對白內障發病過程有重要影響［6］，let-7家族與年齡相關性白內障的嚴重程度和發病年齡顯著相關［7］。

因此，本研究以let-7a為研究對象，利用年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜標本及人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04），通過轉染、紫外線照射、流式細胞技術等方法，測定let-7a對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響并探討其在白內障發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2014年5月至6月在我院眼科診斷為年齡相關性白內障（排除其他眼部疾病）患者的晶狀體前囊膜標本30例（實驗組）。收集我院眼科眼庫提供的新鮮正常人眼晶狀體前囊膜標本30例（對照組）。組織標本收集獲得倫理委員會批準。

1.2 細胞培養和轉染

人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）由美國Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈。利用DMEM培養基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養SRA01/04細胞。

let-7a mimic、let-7a inhibitor及其陰性對照由Ribobio公司合成。將SRA01/04細胞于轉染前24 h接種于6孔細胞培養板中，使轉染時細胞密度達到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）將50 nmol/L let-7a mimic與let-7a mimic control、100 nmol/L let-7a inhibitor與let-7a inhibitor control分別轉染至SRA01/04細胞中，轉染后48 h進行相關檢測。

1.3 紫外線照射誘導細胞凋亡

紫外燈（XX-15B，Spectroline，Westbury，美國）光譜范圍280～320 nm，峰值為312 nm，取對數生長期SRA01/04細胞置于紫外光源下照射，照射強度為360 μW/cm2，照射時間為25 min，建立人晶狀體上皮細胞凋亡模型［6］。照射前將培養液吸凈，PBS沖洗2次。照射時加入0.5 mL PBS，打開培養皿蓋。照射后置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續培養4 h。

1.4 Real time q-PCR檢測let-7a的表達

利用Trizol?Reagent（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（TaKaRa公司，日本）逆轉錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）檢測let-7a的表達量，RNU6B為內參對照。let-7a的RT引物、特異性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司合成。利用ABI 7500（Applied Biosystems，美國），反應體系為20 μL，反應條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。經過3次獨立實驗后得到的數據，利用公式RQ=2-ΔΔCt進行分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（KenGEN公司，中國），用胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min，收集1×105～5× 105個細胞，加入195 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，室溫、避光、孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入190 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入10 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 統計學分析

應用SPSS 16.0統計學軟件。采用獨立樣本t檢驗進行分析，數據以x±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 let-7a在年齡相關性白內障晶狀體組織中的表達

利用Real time q-PCR方法，檢測30例年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜和30例正常人眼晶狀體前囊膜中let-7a的表達情況，結果顯示：實驗組患者晶狀體前囊膜let-7a的表達顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1A。

2.2 let-7a在人晶狀體上皮細胞凋亡模型中的表達

利用Real time q-PCR方法，檢測人晶狀體上皮細胞凋亡模型和正常人晶狀體上皮細胞系（SRA01/ 04）中let-7a的表達情況，結果顯示：人晶狀體上皮細胞凋亡模型組let-7a的表達顯著低于對照組，差 異有統計學意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 let-7a在年齡相關性白內障晶狀體組織和人晶狀體上皮細胞凋亡模型中的表達Fig.1 The expression of let-7a in both the age-related cataract lens tissues and the human lens epithelial cell apoptosis model

2.3 轉染效率的驗證

向SRA01/04細胞中轉染let-7a mimic，mimic negative control，inhibitor，inhibitor negative control，為了驗證轉染效率，轉染后48 h收集細胞，利用Real time q-PCR方法，檢測各組let-7a的表達情況。結果顯示：let-7a mimic轉染組let-7a的表達顯著高于對照組（圖2A），let-7a inhibitor轉染組let-7a的表達顯著低于對照組（圖2B），差異有統計學意義（P＜0.01）。表明后續實驗可按此條件進行轉染。

2.4 let-7a抑制人晶狀體上皮細胞凋亡

圖2 let-7a mimic、inhibitor轉染效率的驗證Fig.2 Verification of the transfection efficiency of let-7a mimic and inhibitor

向人晶狀體上皮細胞凋亡模型中分別轉染let-7a mimic和inhibitor調節let-7a的表達，轉染后48 h，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。結果顯示：let-7a mimic轉染組細胞凋亡率顯著低于對照組（圖3A），let-7a inhibitor轉染組細胞凋亡率顯著高于對照組（圖3B），差異有統計學意義（P＜0.01）。提示let-7a可能抑制人晶狀體上皮細胞凋亡。

3 討論

自1993年首次發現microRNA以來［8］，迄今為止發現的成熟microRNA約一千余種［9］。microRNA通過與mRNA的3′非翻譯區序列完全或不完全互補配對，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制，從而對基因表達、細胞分化、生長發育等進行精細調控［2］。在腫瘤等疾病領域的研究中，已證實microRNA在細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞過程中發揮著至關重要的作用［10，11］。microRNA應用于慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常等疾病治療方面的研究也取得了突破性進展［12～14］。

圖3 let-7a對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控Fig.3 The regulation effect of let-7a on apoptosis in human lens epithelial cells

在眼科領域的研究中發現，一些特異性的microRNA在眼部組織包括晶狀體、角膜、視網膜中有特定性的表達，并具有一定特點［15～19］。例如，Karali等［15］發現在晶狀體上皮細胞和赤道部表達較強的是miR-130、miR-124、miR-149、miR-185等，Ryan等［16］在成年小鼠晶狀體中報道了17種microRNAs，其中miR-184位于上皮細胞，在生發區表達較強，miR-204則均一地表達于所有上皮細胞。近年的研究表明，microRNA在白內障的發病過程中發揮著重要的調控作用［6，7，20］。例如，miR-125b可能通過直接抑制其靶基因p53的表達調控人晶狀體上皮細胞凋亡［6］，miR-184的seed region突變可以導致前極性白內障［20］，miR-31、miR-99a和b可能參與白內障發病，let-7b與年齡相關性白內障的嚴重程度和發病年齡顯著相關［7］。

let-7a是let-7家族的一員，let-7家族是最先被鑒定的microRNA之一［21］。通過TargetScan、Diana-micro T、miRanda等生物信息學軟件預測，let-7a可能與凋亡最主要的通路——線粒體通路中的caspase-3、8、9等基因存在潛在結合的位點，推測let-7a可能通過調控其預測靶基因caspase-3、8、9等的表達，進一步調控細胞凋亡。在對肝癌的研究中發現，let-7a能夠抑制細胞增殖、生長和轉移，因此可能成為肝癌治療的潛在有用分子［22］。let-7a還可能通過抑制cmyc基因的表達抑制人乳腺癌細胞增殖［23］。在對黑素瘤的研究中發現，let-7a可促進黑素瘤細胞凋亡，同時下調caspase-3蛋白的表達［24］。

本研究結果發現，let-7a在年齡相關性白內障晶狀體組織以及人晶狀體上皮細胞凋亡模型中均呈低表達。在細胞凋亡模型中調節let-7a的表達，進一步研究細胞生物學功能的變化，結果發現，上調let-7a的表達后，細胞凋亡率顯著降低，下調let-7a的表達后，細胞凋亡率顯著升高。提示let-7a能夠抑制人晶狀體上皮細胞凋亡，在白內障的發病過程中發揮重要的調控作用，可能成為白內障非手術治療的新靶點。在后續的研究中，將進一步探索let-7a通過調控哪些靶基因的表達調控人晶狀體上皮細胞凋亡，從而影響白內障發病過程的具體分子機制。

綜上所述，let-7a在年齡相關性白內障晶狀體組織中低表達，let-7a能夠抑制人晶狀體上皮細胞凋亡，在年齡相關性白內障發病過程中扮演重要的角色，let-7a可能成為白內障非手術治療的新靶點。

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（編輯王又冬）

Research ofmicroRNA let-7a Inhibiting Human Lens EpithelialCellApoptosisin Cataract

QINYu1，ZHAOJiang-yue1，MINXiao-jie1，LUOWen-ting2，LIJing1，WUXin-wei1，LIUJia1，YANQi-chang1，ZHANGJinsong1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Eye Hospital of China Medical University，Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the regulation of apoptosis of human lens epithelial cells by microRNA let-7a and the effect of microRNA let-7a in cataract.MethodsThe real time q-PCR was used to measure the expression of let-7a in anterior lens capsules of patients with age-related cataract and in normal anterior lens capsules，as well as in human lens epithelial cell apoptosis model and in lens epithelial cell lines.Let-7a mimic and let-7a inhibitor were respectively transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to up-regulate and down-regulate the expression of let-7a，and then the real time q-PCR was used to assess transfection efficiency.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate.ResultsCompared with controls，the expression of let-7a was significantly lower in both the anterior lens capsules of patients with age-related cataract and the human lens epithelial cell apoptosis model.The expression of let-7a was increased in lens epithelial cells transfected with let-7a mimic，whereas it was decreased in cells transfected with let-7a inhibitor，compared with controls.The apoptosis rate was reduced for cells transfected with let-7a mimic，whereasitwas increased forthose transfected with let-7a inhibitor，compared with controls.Allresults were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionmicroRNA let-7a regulates human lens epithelial cell apoptosis and thus plays a critical role in the pathogenesis of cataract，which has the potentialto be a nonoperative therapeutic targetforcataract.

microRNA；let-7a；cell apoptosis；cataract

R776.1

A

0258-4646（2015）04-0302-05

國家自然科學基金（81270988）；遼寧省教育廳科學技術研究一般項目（L2014305）；中國醫科大學附屬第四醫院青年創新發展基金項目（YB1217）

秦宇（1982-），女，講師，博士.

張勁松，E-mail：zhangjs0331@126.com

2014-12-23

網絡出版時間：