三角帆蚌血細胞形態(tài)觀察及蚌齡和溫度對其密度影響

彭本英+袁漢文+庹銳

摘要：研究了三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）血細胞分類、形態(tài)特征以及溫度和蚌齡對三角帆蚌血細胞密度的影響。結(jié)果表明，溫度和蚌齡對三角帆蚌血細胞的密度均有明顯的影響，溫度越高，血細胞密度越高;蚌齡越大，血細胞密度越高;三角帆蚌的血細胞分為大顆粒細胞、小顆粒細胞、透明細胞、淋巴樣細胞、血栓細胞，依次占血細胞總數(shù)的5.5%、56.8%、9.5%、22.5%和5.7%。

關(guān)鍵詞：三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）;血細胞;形態(tài);密度

中圖分類號：S966.22+1 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2857-03

Morphology and Density Effect Factors on Hemocytes of Hyriopsis cumingii Lea

PENG Ben-ying，YUAN Han-wen，TUO Rui

（School of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou ?434025， Hubei， China）

Abstract： In this study， hemocyte classification， morphology of different types in Hyriopsis cumingii， and the effect of temperature and age on hemocyte concentration were studied， which would guide for the disease control of Hyriopsis cumingii. The results showed that temperature and age had significant effects on hemocyte density. The higher temperature， the higher hemocyte density， and there is the same correlation between age and hemocyte density. The haemocytes of H.cumingii were classified as 5 types based on the characteristics， amount of granule and its relative size. There were big granulocyte， small granulocyte， hyalinocyte， lymphoid-like cell and thrombocyte， which account for 5.5%， 56.8%， 9.5%， 22.5% and 5.7% respectively.

Key words： Hyriopsis cumingii Lea; hemocyte; morphology; concentration

貝類沒有免疫球蛋白和淋巴系細胞，其免疫防御功能主要依賴于非特異性免疫[1]，由血細胞來行使免疫防御功能。血細胞是貝類免疫的基礎(chǔ)，不同類型的血細胞在細胞免疫過程中具有不同的功能。三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）是我國培育淡水珍珠的主要蚌種之一，病害的發(fā)生給三角帆蚌培育造成重大的經(jīng)濟損失。三角帆蚌天然免疫系統(tǒng)是抵御外來病原微生物入侵的屏障，主要依靠血細胞的吞噬作用來完成，溶酶體酶、凝集素、抗菌肽等體液免疫因子以殺菌、促進吞噬等方式參與三角帆蚌的免疫防御。目前，國內(nèi)外關(guān)于三角帆蚌的血細胞報道較少，羅文等[2]對其進行了初步研究，并將其血細胞初步分為無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞。本研究對三角帆蚌的血細胞分類形態(tài)特征及密度影響因素進行了研究，旨在為進一步深入研究三角帆蚌的免疫機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 ?材料

三角帆蚌取自湖北省荊州市公安縣某珍珠養(yǎng)殖場，為蚌齡適中、健康無病的2～5齡三角帆蚌。

1.2 ?方法

1.2.1 ?溫度的設(shè)置 ?為了研究溫度對血細胞密度的影響，采用控溫棒加熱方式設(shè)置了12、15、18、21、24、27、30 ℃ 7個不同溫度，將三角帆蚌置于其中暫養(yǎng)1周左右，以待后續(xù)抽取血液。

1.2.2 ?三角帆蚌血細胞的采集 ?首先采用活體直接從閉殼肌抽血，由于活體直接采集，蚌兩殼咬合很緊，操作些許困難。然后采用緩慢加熱（每小時升溫3 ℃），使水溫緩慢上升到30 ℃時，加熱30 min，三角帆蚌處于麻醉狀態(tài)，兩殼自然地微微地張開，從閉殼肌部位容易抽取血液。

1.2.3 ?血細胞的計數(shù)及觀察 ?血細胞大小測量、血細胞計數(shù)和Giemsa染色參照文獻[3]的方法并略作改進。取血后立即滴片，待血細胞貼壁后，用濾紙將上清小心吸干，甲醇固定后空氣干燥，Giemsa染色，DMXY顯微鏡觀察并拍照。血細胞的分類、比例以及特征均以3齡三角帆蚌為研究對象。

1.2.4 ?統(tǒng)計分析 ?采用Duncan's多重比較進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?溫度對三角帆蚌血細胞密度的影響

由圖1可以看出，血細胞的密度從12 ℃的1.42×106 個/mL下降到15 ℃的1.37×106個/mL，然后隨著溫度不斷升高，血細胞密度也不斷升高，30 ℃時達到最高，為2.19×106 個/mL。統(tǒng)計學(xué)分析表明，三角帆蚌處于12～18、21～27、30 ℃ 3個溫度范圍下血細胞密度差異顯著（P<0.05），而在12、15、18 ℃溫度下，三角帆蚌血細胞密度差異不顯著（P>0.05），在21、24、27 ℃溫度下血細胞密度差異也不顯著（P>0.05），這說明在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，三角帆蚌血細胞密度緩慢增加，但溫度升高到一定值后，三角帆蚌血細胞密度則快速增加。endprint

2.2 ?不同蚌齡三角帆蚌血細胞密度

不同蚌齡三角帆蚌血細胞密度差異較大（表1）。由表1可以看出，隨著蚌齡增長，三角帆蚌血細胞密度不斷升高，5齡三角帆蚌血細胞密度顯著高于2～4齡三角帆蚌（P<0.05），2齡和3齡三角帆蚌血細胞密度差異不顯著（P>0.05）。4個蚌齡的三角帆蚌血細胞平均密度為2.09×106 個/mL。

2.3 ?三角帆蚌血細胞分類及特征

盡管三角帆蚌不同蚌齡階段其血細胞密度差異較大，但血細胞形態(tài)及每種血細胞所占的比例變化不大。因而下面以3齡三角帆蚌為例，介紹血細胞的形態(tài)及比例。

大顆粒細胞：胞體較大，橢圓形，胞體中有許多折光性很強的圓形大顆粒，細胞直徑為18.2 μm，占細胞總數(shù)的5.5%，由于大顆粒布滿胞體，所以一般都看不到細胞核。

小顆粒細胞：數(shù)量最多的一類細胞，占細胞總數(shù)的56.8%。胞體圓形或橢圓形，胞體中有許多小顆粒，細胞直徑為13.9 μm。細胞著色較淺，細胞核染成淺紅色。

透明細胞：圓形或橢圓形，細胞很小，直徑僅3.8 μm，占細胞總數(shù)的9.5%。細胞透明，胞質(zhì)少且均勻，無任何顆粒，細胞核居中或偏離一側(cè)，有1～2個細胞核。染色時著色較深，細胞核染成深紅色，細胞質(zhì)透明。

淋巴樣細胞：細胞具有脊椎動物典型的淋巴細胞形態(tài)，呈圓形或橢圓形，直徑約為16.4 μm，占細胞總數(shù)的22.5%。細胞核大，核質(zhì)比大，細胞核周圍僅有一薄層細胞質(zhì)，細胞質(zhì)透明。

血栓細胞：細胞形狀變化多樣，有圓形、橢圓形、梭型等形狀，細胞外具有長短不一的偽足。細胞直徑7.4 μm，占細胞總數(shù)的5.7%。

3 ?討論

近年來，雖然對貝類特別是雙殼類血細胞的形態(tài)和功能等已進行了大量的研究，但由于分類標準不一，特別是因為不同貝類的血細胞在形態(tài)上存在較大的差異，對貝類血細胞的分類迄今仍存在較大的分歧。大多數(shù)學(xué)者將貝類的血細胞分為兩大類，即透明細胞（無顆粒細胞）和顆粒細胞（包括大顆粒細胞和小顆粒細胞），如貽貝（Mytilus edulis）[4]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）、牡蠣（Crassostrea virginica）[5]、中國蛤蜊（Mactra chinensis） 和紫石房蛤（Saxudomus purpuratus）[6]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、海灣扇貝（Argopecten irradians）、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）和毛蚶（Scapharca subcrenata）[7]。但在許多貝類中又發(fā)現(xiàn)了其他類型細胞，如在牡蠣和硬殼蛤的血細胞發(fā)現(xiàn)了纖維細胞[8]、黃硨磲（Tridacnacrocea）中觀察到了桑葚樣細胞[9]、褶紋冠蚌（Gristaria plicata Lea）血細胞中發(fā)現(xiàn)有漿細胞[10]、橢圓背角無齒蚌（Anodonta woodiana elliptica）中發(fā)現(xiàn)有淋巴樣細胞[11]、池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）中發(fā)現(xiàn)有漿液細胞、淋巴樣細胞、梭形細胞和血栓細胞[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，三角帆蚌除了羅文等[2]報道的顆粒細胞和透明細胞外，還有淋巴樣細胞和血栓細胞。雖然根據(jù)形態(tài)學(xué)方法對貝類血細胞進行分類，導(dǎo)致結(jié)果不一致，但由于形態(tài)學(xué)的分類方法比較簡單實用，并且其他分類方法（外源凝集素標記法、單克隆抗體技術(shù)、免疫探針技術(shù)）也同樣存在著缺陷。

貝類血細胞的密度在不同的物種中差別很大甚至在同一物種中也因年齡、生理狀況、環(huán)境壓力和研究方法的不同而變化[13，14]。例如硬殼蛤[15]和辛辣梨溝貝（Scrobicularia plana）[16]個體間血細胞密度差異很大。本研究中2～5齡三角帆蚌血細胞平均密度為2.09×106 個/mL，這與貽貝、大刀蟶（Ensis siliqua）[17]、齒蝶蚌[12]、褶紋冠蚌[18]等蚌的血細胞密度處于同一數(shù)量級。血細胞數(shù)量是貝類重要的生理指標，許多研究表明貝類血細胞密度還受溫度的影響[18，19]。三角帆蚌血細胞在低溫12～18 ℃之間平均密度為1.44×106 個/mL，在21～27 ℃之間血細胞平均密度為1.83×106 個/mL，30 ℃時為2.19×106 個/mL。同為淡水育珠蚌的褶紋冠蚌也有此規(guī)律，15 ℃時褶紋冠蚌血細胞密度為1.90×106 個/mL，30 ℃時血細胞密度達2.62×106 個/mL，但超過30 ℃血細胞密度反而下降[18]。在一定的溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高，貝類血細胞密度才不斷上升，超過一個溫度界限，溫度上升，密度反而下降[19]。影響血細胞密度除了上述描述的因素外，還有病原菌的感染情況[14]，與健康的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）相比較，受感染的櫛孔扇貝其血細胞密度下降了8%。雖然影響血細胞密度的因素很多，但在南美洲貽貝（Perna perna）研究發(fā)現(xiàn)，性別并不影響其血細胞密度[20]。

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