流式細胞儀分離工作犬XY精子的研究

韋云芳，張躍駿，唐樹生，陳方良，程魯光，黎立光，劉 慶，杜曉鵬，毛愛國，汪 斌，萬九生*

(1.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204； 2.警犬技術公安部重點實驗室，云南昆明 650204；3.公安部警犬技術學校，遼寧沈陽 110034)

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流式細胞儀分離工作犬XY精子的研究

韋云芳1,2，張躍駿1，唐樹生1,2，陳方良1,2，程魯光1,2，黎立光2，劉 慶3，杜曉鵬1,2，毛愛國1,2，汪 斌1,2，萬九生1,2*

(1.公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204； 2.警犬技術公安部重點實驗室，云南昆明 650204；3.公安部警犬技術學校，遼寧沈陽 110034)

[目的] 探索適用于犬性別控制的流式細胞儀分離精子的方法。[方法] 采集昆明犬和德國牧羊犬的精液，采用不同濃度(6、8、10、12 μl/ml)的Hoechst 33342對精液進行染色，探討不同濃度的熒光染料Hoechst 33342及公犬個體對精子分離效果的影響。[結果]當Hoechst 33342濃度分別為6、8、10 μl/ml時，X和Y精子的DNA差異不能被分辨成雙峰，只有當Hoechst 33342為12 μl/ml時，X/Y雙峰能有效并穩定地分離。不同公犬的鮮精死精率與X/Y精子分離速度呈明顯負相關性，而分離準確率則與鮮精死精率無明顯相關性。[結論] 當Hoechst 33342濃度為12 μl/ml時，流式細胞儀能將警犬X、Y精子成功分離。選擇適宜的種公犬對提高精子的分離效率和分離精液的品質都有重要意義。

流式細胞儀；犬； XY精子分離；性別控制

性別控制技術(Sexing technology)是指人為干預動物的正常生殖活動，使動物能夠按照人們的意愿繁衍所需性別后代的一種繁殖技術。動物性別控制對人類而言是一項巨大的挑戰，同時具有潛在的重大利用價值。在人類，后代性別的選擇可以有效避免性別連鎖遺傳疾病的發生[1-2]。在畜牧業生產中，動物許多重要經濟性狀都與性別密切相關，通過性別控制技術不僅能使特定性別的家畜發揮其性別相關的生產優勢，獲得最大的經濟效益，而且在繁育工作中可以加快品種改良進程，提高育種效率[3-5]。另外，性別控制技術對瀕危動物及野生珍稀動物資源的保種、繁殖擴群及遺傳科學的發展都具有十分重要的意義[6-7]。

目前，常見的動物性別控制方法主要有2類：受精后早期胚胎的性別鑒定技術和受精前X、Y精子的分離技術[8]。其中，在受精前分離X、Y精子是比較理想的、根本的性別控制方式[9]。長期以來，根據雄性動物的X、Y精子在體積、密度、電荷、運動性和表面抗原等方面存在的差異，依靠物理、化學和生物學的原理，人們也嘗試了多種方法來實現精子的分離[10-13]。在眾多的精子分離方法中，流式細胞儀分離法是目前最可靠且高效的X、Y精子分離方法[14-17]。作為新涌現出的一種輔助生殖技術，流式細胞儀分選精液技術是基于X和Y染色體間DNA含量的微小差異(X精子的DNA含量比Y精子多3%～5%)[15]，利用這種差異，采用能與DNA特異結合的熒光染料Hoechst 33342，以熒光染色后通過流式細胞儀檢測的X、Y精子所發射熒光強度的差別來判定X、Y精子的不同并使其分流，從而達到分離的目的[18-19]。

使用流式細胞儀進行精液X、Y精子分離也是唯一在應用上取得進展的技術，在牛的性別控制中該技術已經實現商業化應用[20]。奶牛業中應用流式細胞儀分離的X精子冷凍精液人工授精在生產中已經得到廣泛應用，產母犢率可達90%以上。另有多種家畜已采用精液性別分選技術成功產出預控性別的后代，如豬、羊、馬[21]。為了擴大精液分選技術的研究與應用，多種瀕危和珍稀的野生哺乳動物的精液被有效分離，如靈長類[22]、海豚[23]、羊駝[24]、大象[25]、水牛[26]、犀牛[27]等。

在犬上，精液分選技術的研究與發展同樣能夠帶來廣泛的應用和巨大的利益。精液分選技術與精液冷凍保存技術、人工授精(AI)技術的結合，對于商業化寵物犬、純種犬的繁育意義重大[28]。在警用工作犬領域，犬的專業方向與工作性能常常與其性別緊密相關，該技術的應用能使繁育工作者根據實際需要(工作方向或保種)選擇工作犬的性別，以提高工作犬繁育的工作效率和工作犬的實戰作用，加快工作犬品種改良的步伐。目前，有關犬X、Y精子分離的研究報道十分匱乏，國內尚未見到相關報道。國外Meyers等[29]曾報道應用流式細胞儀分選精液產下拉布拉多犬性控后代，但缺乏更多關于分選過程的研究報道。Rodenas等[30]則對5個品種的犬(金毛獵犬、法國斗牛犬、伊比贊獵犬、魏瑪犬及蘇格蘭梗)進行了流式細胞儀分選精液的研究，但不同品種犬、不同環境與試驗條件下精子分離效果差異較大，其報道的分選條件不一定適合我國環境條件下不同品種犬的精液分選。筆者探索利用流式細胞儀進行國內繁育飼養的警用工作犬(昆明犬和德國牧羊犬)X、Y精子分離的技術體系，以期為工作犬及其他犬種的性別控制技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備流式細胞儀(MoFlo-SX,DakoCytomation Inc.,Fort Collins,CO,USA)、單頭精液灌裝機(法國IMV)、精子密度儀(AccuCell，法國IMV)、超聲波細胞破碎儀、倒置熒光相差顯微鏡、冷凍離心機、恒溫水浴槽、液氮罐等。

1.2 主要試劑與藥品Hoechest 33342(Sigma,St.Louis,MO,USA)、Food Colouring Dye(FD&C#40; Warner Jenkinson Company Inc.,St.Louis,MO,USA)、配液(改良TALP稀釋液、分離鞘液、精子接收液、Tris A/B凍存液等)所用試劑及其他試劑除特別指出外，均為Sigma公司產品。

1.3 試驗動物試驗中所用公犬分別來自公安部昆明警犬基地(昆明犬)和山東省公安廳警犬基地(德國牧羊犬)健康、正常使用的種公犬。

1.4 試驗設計

1.4.1不同的Hoechst 33342濃度對X、Y精子分辨率的影響。該試驗的目的是研究不同的Hoechst 33342染料濃度對精子分離時X精子和Y精子DNA飽和分辨率的影響。在精子染色體系(1 ml，體系中精子染色后終濃度為1×108個/ml)中分別加入6、8、10、12 μl的Hoechst 33342(5 mg/ml)染色液進行染色。以流式細胞儀檢測定向正確精子的X峰和Y峰的分辨情況為評定標準。

1.4.2公犬鮮精質量對分離效果的影響。該試驗旨在探討來自同一種公犬的不同密度、活率的精液對精子分離效率和分離效果的影響，主要考察指標有分離過程中的死精率、分離速度和分離準確率等。

1.4.3不同個體公犬精子分離效果的比較。該試驗利用流式細胞儀對不同個體公犬精液的分離效果進行了分析，初步探討經流式細胞儀分離的6頭種公犬精液在分離過程中的死精率、分離速率和分離準確率等分離指標的差異。

1.5 試驗方法

1.5.1精液采集和處理。采集的鮮精恒溫保存于21 ℃車載冰箱中，并盡快送交山東奧克斯生物技術公司精子分選實驗室。在顯微鏡下評估精子活力、活率及形態正常率等指標，使用精子密度儀測定精子密度。在室溫(22～23 ℃)條件下將原精與稀釋液(改良TALP液)以1∶2(V/V)比例稀釋后，2 200 r/min離心10 min，棄掉上清并重新加入一定量的稀釋液，將精液濃縮到5×108個/ml以上。

1.5.2精子的染色。根據濃縮后精子的密度，計算出染色時所要加入稀釋液和精液的量。按順序向5 ml分離管中分別加入12 μl Hoechst 33342熒光染料(5 mg/ml)、稀釋液、精液(總體積為1 ml)，混勻后在34 ℃水浴避光孵育，每隔15 min搖晃1次，以保證精子染色的一致性。經50 min的水浴孵育后，再加入同溫同體積的Food coloring染液(含有4%卵黃和0.002%的食物染料)，最終精子濃度為1×108個/ml，然后將精液經50 μm孔徑的濾器過濾。

1.5.3使用流式細胞儀進行精子分離。過濾后的染色精子盡快使用流式細胞儀進行X、Y精子分離。分離條件：鞘液(含0.1% BSA和0.1% EDTA的PBS)壓力37 Psi，激光照射強度175 mW。分離精子收集在50 ml的離心管中，離心管中預先加入約2 ml接收液(Tris A稀釋液)。當分離時間達到30 min或分離精子數量達到50萬個時，輕輕搖晃收集管，以使搖勻精子和卵黃。分離后的精子進行冷凍保存，最終投入液氮保存。

1.5.4分離精子的準確率評估。解凍后的分選精液測定活率后，采用流式細胞儀重分析法測定分離精子的準確率。具體操作為：取5 ml分離管，先加入12 μl熒光染料，再加入1 ml Tris鞘液(pH 8.0)，最后將解凍后精液加入管內，精液體積不低于20 μl。上下顛倒搖晃幾次(注意動作要輕)，放入34 ℃水浴鍋溫育20 min。溫育完成后，用超聲波處理分離后精子(脈沖設為6，時間為1 s)，調整好儀器進行再分離，根據軟件要求計算出分離樣品X、Y精子的準確度。

1.5.5數據的記錄與統計分析。在精子上機分離過程中，記錄儀器上顯示的每份精液樣品的分離參數(包括分離速率和死精率)，應用SPSS 20統計軟件包對試驗數據進行單因素方差分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 X、Y精子在不同的染料濃度下DNA含量差異的分辨結果引入“分效”(分效 = 雙峰交疊處高度/整個峰高)這個概念來更好地說明XY精子DNA含量差異的分辨效果(圖1)。分效數值越小，表示X、Y精子的分離效果越好；反之，則表示分離效果不佳。分效數值最大為1，表示X精子和Y精子的DNA含量雙峰交疊，不能分辨。

精液樣品上機分離結果顯示，犬精子在Hoechst 33342加入量分別為6、8和10 μl的染料濃度下不能有效地將X精子和Y精子根據DNA含量的差異分辨成雙峰，或雙峰的分離并不穩定，剛上機充壓瞬間進入流式細胞儀檢測的精子數量較多，能見微弱分效(約0.8～0.9)，但隨著進樣量的減少，XY精子幾乎不能分離，分效約為1。當染料加入量為12 μl時，雙峰能有效并穩定分離，分效約為0.25～ 0.75，平均分選速度約為2 000個/s。

2.2 精液的分選結果多頭種公犬的精液通過初步試驗，但只有6頭種公犬的精液能夠上機分選，共獲得分選凍精約120支，分選速度約為1 400～2 500個/s。經純度檢測，X、Y精子分選的準確率約為90%～ 92%。精子上機分選圖例圖2A～C，分選精子純度分析圖見圖2D～E。

2.3 公犬鮮精質量對分離效果的影響影響精子分離速度和效果的因素很多，流式細胞儀自身的硬件設施、調試狀態、鞘液壓力、精液品質、染色效果等都將對其產生影響。該試驗在其他條件基本一致的前提下重點對同一種公犬不同密度、活率精子的分離效果進行比較。由表1可知，精液密度大、活率好，分離效果越好，分離速度越快。分離準確率與精液品質關系不大。這是因為分離準確率更多取決于分離時儀器的調整狀態、所取區域的百分比及噴嘴等其他因素。

2.4 不同公犬精子分離效果的比較筆者對6頭種公犬精子的分離效果進行了比較。從表2可以看出，不同個體公犬個體的精液分離速率、死精率存在較大差異。然而，種公犬的精液品質雖然會影響精子的分離效率，但對分離準確率的影響不大。精液品質越好，死精率越低，精子的分離速率越快。因此，選擇適宜的種公犬對于提高精子的分離效率和分離精液的品質都有著重要的意義。

3 討論與結論

該研究屬國內首次報道使用流式細胞儀對犬XY精子的分離，并成功獲得高純度的X和Y性控精液，犬XY精子的成功分離和冷凍保存將為犬性別控制的研究與應用奠定基礎。

3.1 流式細胞儀分離犬精子試驗條件的探索使用流式細胞儀分離精子是目前最成功的哺乳動物精子分離方法，其依據哺乳動物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，通過Hoechst 33342熒光染料對精子的DNA飽和著色，在精子通過流式細胞儀時根據這個細微的熒光差別將X和Y精子分離[31]。因此，合適的染料濃度是進行精子分離首先要確定的分離指標。若染料濃度過低，當反應的Hoechst 33342沒有達到飽和DNA所需濃度時，不同的精子因為自身生理生化差異而結合上不等量的染料，這些不等量的結合而導致的差異掩蓋了X和Y精子之間DNA的差異，因而雙峰不能分辨；當Hoechst 33342超過飽和DNA所需濃度時，結合上的量與恰巧飽和時的量并沒有顯著差異，因而雙峰分辨的程度也將不會有明顯改變。只有在合適的染色濃度下X/Y精子恰恰能飽和著色，才能進行有效分離[32]。該試驗結果表明，在Hoechst 33342加入量為12 μl染色條件下，犬XY精子能得以有效分離。然而，高濃度熒光染料的染色會對精子產生損害作用。因此，在精子分離過程中為確保生物安全性，應盡可能在分辨率允許的情況下使用低濃度的熒光染料對精液樣本進行處理。由于該試驗中設計的梯度濃度(6、8、10、12 μl)跨度相對較大，今后可以嘗試縮小濃度梯度，摸索出適合犬精子分離的較低濃度的染料條件。

表1 公犬精子活力對X/Y精子分離效果的影響

表2 不同公犬精子分離效果比較

另外，在試驗中發現其他染色條件(如水浴溫度、水浴時間)也會對精子質量和精子的分離產生一定的影響，水浴溫度過高，水浴時間過長，精子的分離越不穩定，對精子質量的不利影響也越大。目前，34 ℃水浴條件下水浴50 min是比較理想的染色條件。

除以上影響XY精子有效分離的重要因素外，另一重要影響因素可能是犬本身的身體素質和生理狀況、犬個體之間以及個體不同的時間、環境下生精狀況的差異。如同一頭犬隨著季節和環境的變化會產生相應的應激反應，從而導致體內精子濃度和精漿物質發生變化，引起精子生理生化結構的改變，進而導致分離過程中所需分離條件的差異，如染色中Hoechst 33342飽和DNA難易程度的差異等。該研究報道的Hoechst 33342有效分離濃度與Rodenas等[30]所報道的有效染色濃度有較大差異，其具體的影響因素和機理還有待進一步研究。3.2 犬精子的分選理論上，犬XY精子的DNA含量差異較大(3.9%)，應較易于分選。該研究結果表明，犬精子分選后主要指標都能夠基本滿足低劑量人工授精(AI)的要求。冷凍后重分析發現，X、Y精子純度分別達到90%和92%，是分選成功的直接指標之一。雖然此次試驗成功獲得了犬冷凍XY精子，但分離效率遠遠低于奶牛，主要原因可能包括：①犬精液濃度較牛低，保存運輸后活力差；②種公犬一次采集的精液總量較低；③大部分分選參數是參照牛的標準設定的，因此將來通過改良和優化犬精子分選參數可能會進一步提高其分離效率。

3.3 犬分選精子的應用流式細胞儀分離精子技術若與體外受精和顯微受精等輔助生殖技術相結合，將有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景。然而，高分選費用是限制該技術應用的主要因素。以奶牛業為例，國內用于奶牛性別控制的分離精子已經商業化生產，含200～250萬精子、活率0.5的每支0.25 ml細管售價為200～300元。因此，分離精子目前僅限于少數科研和育種場應用，其推廣仍受到很大限制。隨著儀器的改善、分選效率和低劑量輸精技術水平的提高以及相應成本的降低，XY精子分離的性別控制技術必將得到更為廣泛的應用與推廣。另外，隨著研究人員對犬越來越多的關注及犬生殖技術研究的深入與發展，犬分選精液必將在警犬和其他犬業繁育中獲得廣泛應用。

利用流式細胞儀分離犬精子進行性別控制的方法是可行的，對犬使用流式細胞儀分離法和冷凍技術成功獲得了高純度冷凍的X、Y精子。該精子分離技術具有操作簡便、思路新穎、方法獨特、準確率高、便于推廣等特點。雖然目前流式細胞儀分離法也存在劣勢(如分離精子的速度較慢、儀器價格昂貴、分離成本高等)，但隨著儀器的改進和各項輔助生殖技術的深入研究、發展，性控精液必將在警犬及其他犬種的生產中得到廣泛應用，產生巨大的社會效益和經濟效益。

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Study on the Sperm Sex-sorting of Working Dogs by Flow Cytometry

WEI Yun-fang1,2,ZHANG Yue-jun1, TANG Shu-sheng1,2,WAN Jiu-sheng1,2*et al

(1.Kunming Police Dog Base of Ministry of Public Security,Kunming,Yunnan 650204; 2.Key Laboratory of Police Dog Technology,Ministry of Public Security,Kunming,Yunnan 650204)

[Objective] The research aimed to explore the sex-sorting method of canine spermatozoa by using flow cytometry.[Method] The semen samples were collected from Kunming dogs and German shepherd dogs and stained with different concentrations (6,8,10 and 12 μl/ml) of Hoechst 33342.The influences of different concentrations of Hoechst 33342 and different dog individuals on the sex-sorting efficiency were discussed.[Result] When the concentrations of Hoechst 33342 was 6, 8, 10 μl/ml,fresh canine sperm could not be effectively separated.When the concentration of Hoechst 33342 was 12 μl/ml,fresh canine sperm could be effectively and stably separated.The death rate of sperm in fresh semen of different male dogs showed an obvious negative correlation with the sex-sorting speed,but the sex-sorting accuracy had no obvious correlation with the death rate of sperm in fresh semen.[Conclusion] When the concentration of Hoechst 33342 was 12 μl/ml,the sex-sorting of canine spermatozoa could be successfully performed by using flow cytometry.It was of great significance for improving the sex-sorting efficiency of sperm and the quality of separated sperm to select suitable male dog.

Flow cytometry; Canine; Sperm sorting; Sex control

公安部應用創新計劃項目(2011YYCXKMJQ167)。

韋云芳(1986- )，女，云南保山人，助理研究員，碩士，從事警犬分子遺傳育種。張躍駿(1978- )，男，江西吉安人，助理研究員，碩士，從事警犬技術研究。韋云芳與張躍駿為同等貢獻作者。*通訊作者，副研究員，碩士，從事警犬輔助繁殖生物技術研究與應用。

2015-02-02

S 865.3+1

A

0517-6611(2015)09-095-04

鳴 謝衷心感謝山東省公安廳警犬基地和山東濟南奧克斯生物技術公司對該研究的大力支持！