納米細菌及其與結石性疾病的研究進展

王晶晶　朱明利　劉壽榮★

納米細菌及其與結石性疾病的研究進展

王晶晶朱明利劉壽榮★

納米細菌（NB），又稱為納米鈣化顆粒（CNP），是納米級的球形或球桿狀顆粒，它是單純的晶體結構還是新的生命形式是現代微生物學一個最大的爭議，雖然納米細菌的性質仍在爭論中，但對其的研究已經在醫學領域展開，尤其與病理性鈣化疾病的研究取得了較大的進展，本文就其做一綜述。

1　納米細菌

1.1納米細菌的生物學特征 納米細菌是芬蘭科學家Kajander等［1］在胎牛血清中首先發現并命名的特殊生物微粒，直徑約80～ 500nm，革蘭染色陰性，呈球狀或球桿狀，細胞壁厚，無莢膜與鞭毛。廣泛存在于礦物質中和生物體內，存在于人體的血液、尿、膽汁、前列腺液和其他許多器官組織中。Kajander等［1］將從胎牛血清中分離得到的納米細菌進行16S r RNA檢測，并將其歸類于α2亞群布魯菌（包括巴爾通體屬和布氏桿菌屬）。由于缺乏令人滿意的16SrRNA 序列，故又稱其為納米鈣化顆粒（CNP）。其具有獨特的生物礦化特性：在pH7.4的生理性鈣磷濃度中，能分泌羥基磷灰石類的鈣化物，形成礦化的生物被膜，覆蓋于菌體周圍，使其能耐受高溫、強酸等多種不利理化因素，并能抵抗多種抗生素的打擊。1.2 納米細菌的培養 納米細菌培養條件：37℃、pH7.4、5%CO2，細胞培養基DMEM或RPMI1640，加入10%胎牛血清更利于繁殖，但其仍生長緩慢。NB倍增時間為3d，傳代1次/月，可連續傳5年，并能保持原有的生長特性。有文獻報道在培養基中加入堿性磷酸酶可加速其生長。郭亞楠等［2］對納米細菌的培養進行探討，一方面改進培養基，將10%胎牛血清的濃度提高到30%，認為既增加了營養，又減少了因為換液而帶來的污染；另一方面，分別采用細菌培養箱和細胞培養箱進行納米細菌培養，結果顯示在生長速度方面兩者差異不大，但是兩組納米細菌的外殼狀態差異明顯，細胞培養環境下納米細菌只有少量礦化外殼，而細菌培養環境下納米細菌產生很厚的礦化外殼。

1.3納米細菌的檢測 目前對納米細菌的檢測主要包括：

免疫組化染色法、透射電鏡掃描法、鈣染色法、PCR法、Hoechst33258DNA染色法等。但以上方法存在著一定的非特異性，故一般聯合采用多種方法對其進行檢測鑒定。（1）免疫組化染色法：是公認的金標準。利用無水乙醇/乙醚（1：1）混合液固定15min，采用SABC法。判斷標準：在高倍視野可見微小的黃色至棕黃色桿狀或球狀顆粒者為納米細菌。（2）間接免疫熒光法：一般采用單克隆抗體免疫熒光法。4%多聚甲醛固定15min，水洗70℃烤10min，滴加一抗（8D10），37℃孵育60min，PBS沖洗（2min×3次），滴加二抗，37℃孵育40min，PBS沖洗（2min×3次），80%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。判斷標準：高倍視野下可見綠色的桿狀或球狀顆粒分布。（3）透射電鏡掃描（負染法）：將標本用2.5%的戊二醛固定，將細菌稀釋液滴在有膜的銅網上，靜置數分鐘后，用濾紙尖吸掉，用3%磷鎢酸染色1～2min，置于電鏡下觀察照相。判斷標準：呈球狀或球桿狀，大小100～500nm，菌體周圍有一層黑色物質包繞。（4）掃描電鏡法：將培養物低溫離心沉淀（14000g、4℃、30min），沉淀用PBS反復沖洗3次，3%戊二醛固定（4℃、2h），1%四氧化二鋨（4℃、1h），梯度乙醇脫水，臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡下觀察。判斷標準：納米細菌成簇成長，球狀或桿狀，外殼呈毛刺狀。（5）鈣染色 包括Dahl McGee-Russel茜素紅鈣染色和Von kossa染色法。Dahl McGee-Russel茜素紅鈣染色：將標本涂片固定，2%茜素紅2s染液初染2～5min，0.2%淡綠水溶液復染20～30s，0.5%醋酸水溶液速洗；95%乙醇和100%乙醇脫水，烘干后用二甲苯透明中性樹膠封固，顯微鏡觀察。判斷標準：油鏡下觀察納米細菌體積極其微小，聚集成簇。Vonkossa染色法：標本滴于載玻片上，放入5%硝酸銀溶液中避光15min，于紫外燈下照射15 min，沖洗3 min，5%硫代硫酸鈉水溶液處理，沖洗3 min，0.1%核固紅染液復染1 min，蒸餾水洗3 min。判斷標準：染色后納米細菌呈棕褐色。（6）PCR法：對用PCR法檢測納米細菌存在很大的爭議，有學者認為納米16sRNA序列與周圍環境中的污染菌高度同源，故認為PCR法對納米細菌的鑒定沒有任何意義。但有些學者亦認為PCR法不需要培養，縮短了檢測的時間，減少了污染，是簡單、快速、低成本的檢測方法。郭桂林［3］分別用PCR和ELASA法檢測肝病患者血中納米細菌（NB），結果顯示兩種方法差異無統計學意義，認為PCR法對NB的檢測是一可靠的檢測方法。（7）Hoechst33258進行DNA染色：Hoechst33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光燃料，常用于細胞凋亡檢測，也用于普通細胞核染色，或常規DNA染色。Kajander等將用Hoechst33258進行DNA染色，發現濃度由0.5mg/ml提高至5mg/ml，熒光顯微鏡下可見特征性的熒光。而Raoult等研究發現不著色。此外，還有熒光定量RT-PCR法，免疫電鏡法等。

1.4關于納米細菌的爭議 爭議主要體現在以下幾個方面：（1）大小：納米細菌的直徑大約為80～ 500nm，研究認為一個具有自我復制能力的生命形式的最小尺寸大約為140 nm，但Glass等［4］研究亦發現支原體能達到更小的尺寸，僅含43個RNA編碼基因和387個蛋白質編碼基因，所以僅從大小不能判斷NB是否為微生物。（2）新陳代謝：納米細菌的新陳代謝極其緩慢，是普通細菌的萬分之一，具有有限的新陳代謝。然而barba等［5］將H-NMR光譜用于評估NB培養基的代謝改變，結果顯示培養6周的培養基與未培養的培養基沒有區別，認為未檢測到任何代謝活動。（3）自我復制：納米細菌能進行自我復制，掃描電鏡下可見到納米細菌一分為二以及融合成一個團塊等表現。但Young等［6］研究將其定義為仿生特性，包括細胞樣和組織樣的外形，具有生長、增殖和傳播的能力，但其本質是被胎球蛋白包裹的純粹的納米羥基磷灰石顆粒。（4）16S rRNA：目前為止，仍缺乏準確的基因組序列，而其16SrRNA又被有些學者認為是實驗污染。有學者發現納米細菌的16SrRNA 同紫金牛葉桿菌幾乎相同。Barba等［5］將培養6周的CNP進行實時PCR，在排除已知的細菌外，所有樣本的16sRNA均呈陰性。（5）核酸：是否具有核酸，是納米細菌是否為微生物的一個爭議重點。Kajande等［1］用Hoechst33258對納米細菌DNA進行染色，將濃度由0.5ml提高至5ml，在熒光顯微鏡下見特征性的熒光，由此認為納米細菌存在DNA。但是Raoult［7］應用hoechst 33258進行DNA染色，結果顯示不著色，從而認為納米細菌不存在核酸。Miller等［8］將DNA探針放入納米細菌勻漿，結果提示納米細菌存在核酸。（6）單克隆抗體：單克隆抗體的特異性也受到質疑，Martel和Young［9］報道，認為這些抗體能與人類和牛血清白蛋白（BSA）起反應，因此不能作為一個活的微生物的特異性標志物。Hiromi Kumon［10］等也提出了一些NB的單克隆抗體，研究顯示所有的IgG類抗體對各種已知的蛋白質顯示出特異性，也包括BSA。

2　納米細菌與疾病

2.1納米細菌的細胞毒性和致病機制 現有研究認為納米細菌具有細胞毒性，能感染細胞和組織，分泌鈣化脂多糖生物膜，使細胞內外發生鈣化，并分泌一些細胞毒素及細胞因子，引起感染組織的炎癥反應，伴炎癥因子的趨化與釋放，最終導致細胞的空泡樣變性、溶解或凋亡。于澄釩等［11］將NB與腎小管上皮細胞共培養，觀察到大量細胞胞體膨脹增大，胞核及胞漿松散，部分胞膜溶解或核仁不可見，少數細胞胞漿內可見空泡樣變。Zhang MJ等［12］將NB和人工合成的納米羥基磷灰石（nHAPs）分別作用于MDA-MB-231人乳腺癌細胞，觀察到NB和nHAPs都會降低癌細胞活性，促進癌細胞凋亡，但是NB的作用明顯強于nHAPs，可能是源于NB能產生有毒的代謝物或其蛋白質成分。

2.2納米細菌與病理性鈣化疾病 目前的研究認為納米細菌在疾病的發生發展過程中起重要作用，尤與病理性鈣化的關系密切。1998年Kajander等［1］對腎結石與NB關系進行研究，開啟了NB與疾病研究的先河，認為NB是作為結石核心而起作用，類似于幽門螺桿菌。

近年來研究認為納米細菌是血管病理性鈣化的一個潛在原因，研究主要集中在二尖瓣環鈣化［13］、冠狀動脈鈣化［14］、

動脈粥樣硬化［15］等。膽結石的形成是多因素作用的結果，主要包括細菌感染、脂代謝紊亂、膽囊動力學紊亂、致石基因與遺傳等方面。而膽汁納米細菌感染與膽囊結石的發生有關。張雷等［16］將膽汁中培養出的納米細菌與大腸桿菌進行共培養，并進行茜素紅鈣染色，發現共培養組的鈣染色呈桔紅色，而普通大腸桿菌呈淡紅色，認為納米細菌通過直接附著和侵入大腸桿菌的方式引起大腸桿菌發生生物礦化作用。王利明［17］將一定量的納米細菌注射到兔子膽囊中，作用2周后，可見膽囊中形成結石（15/20），與對照組差異顯著（2/10）。通過紅外光譜定性分析，歸類為黑色素結石。劉亞楠等［18］將納米細菌感染日本大耳白兔，顯示有膽結石形成，其結果與王利民等的研究一致。此外，納米細菌與胎盤鈣化［19］、牙結石［20］等關系密切。

2.3針對納米細菌的治療 抗納米細菌療法：由乙二胺四乙酸（EDTA）和四環素組成，其機制為EDTA先溶解納米細菌的鈣化外殼，再發揮四環素的穿透殺菌作用。有研究表明抗納米細菌治療，能有效改善冠脈的狹窄程度，緩解心絞痛癥狀。袁宇峰［21］等將該療法應用于Ⅲ型前列腺炎，經過為期3個月的治療患者的納米細菌陽性率、前列腺液卵磷脂小體及NIH-CPSI評分均較治療前有明顯改善。明愛民等［22］研究認為四環素可作為納米細菌感染的Ⅲ型前列腺炎效果顯著，可作為一線藥物。

3　研究展望

未來的研究可從以下幾個方面展開：（1）繼續完善其DNA 序列的提取，擴大納米細菌樣本的研究。（2）由于納米細菌的培養周期長，不利于對納米細菌進行研究，應進一步探索其培養方法。（3）納米細菌的致病機制有待進一步研究，根據其細胞毒性，可以用于化療等方面。（4）尋求更直接、準確的檢測方法，運用于臨床檢驗。（5）抗納米細菌療法來預防、治療結石相關疾病。

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杭州市衛生局重點項目（2010z008）

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