激素性股骨頭壞死患者血漿microRNA表達譜及生物信息分析

孫楠，樊粵光，李鵬飛，曾意榮，曾建春

(1廣州中醫藥大學，廣州510405；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院)

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激素性股骨頭壞死患者血漿microRNA表達譜及生物信息分析

孫楠1，樊粵光1，李鵬飛1，曾意榮2，曾建春2

(1廣州中醫藥大學，廣州510405；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院)

摘要：目的分析激素性股骨頭壞死(SONFH)患者血漿microRNA表達譜變化及生物信息內容，并探討其意義。方法選取SONFH患者(觀察組)和健康志愿者(對照組)各6例，采用Real-time PCR法檢測其血漿microRNA相對表達量，篩選差異表達的microRNA。采用TargetScan、mirBase及miRanda三個在線數據庫預測交集靶基因，分別進行功能富集性分析和信號轉導通路富集(Pathway)分析。結果共檢測768個microRNA，兩組差異表達的microRNA 16 個，其中觀察組上調10個，比較明顯的是hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-887(觀察組/對照組>3)；下調6個，比較明顯的是hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p(觀察組/對照組<0.5)。三個在線數據庫共篩選出交集靶基因887個，其中上調microRNA 483個，hsa-miR-1207-5p未檢出交集靶基因，hsa-miR-887檢出交集靶基因為GSK3A和CASK；下調microRNA 404個，hsa-miR-96-5p檢出交集靶基因114個，hsa-miR-576-5p檢出59個。功能富集性分析顯示，兩組差異表達microRNA調控的靶基因功能主要包括解剖結構形態、間充質細胞增殖、細胞代謝過程等，Pathway分析顯示靶基因明顯富集于各種信號通路。結論SONFH患者血漿microRNA明顯上調的是hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-887，明顯下調的是hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p，microRNA異常表達可能通過各信號通路參與SONFH的發病。

關鍵詞：股骨頭壞死；糖皮質激素；微小RNA；基因表達譜

股骨頭壞死(ONFH)主要發生于青壯年[1]，包括創傷性和非創傷性，后者又分為激素性、酒精性。其中激素性股骨頭壞死(SONFH)發病隱匿，常在出現股骨頭塌陷后才表現出髖部、腹股溝中點處疼痛，關節活動受限等，嚴重影響患者的生活質量[2，3]。目前SONFH發病機制仍不明確。microRNA是一類長18～25 nt的內源性小分子非編碼RNA，通過堿基互補配對的方式識別特定編碼序列的mRNA，影響其翻譯過程，從而起到調控基因表達的作用[4]。microRNA 廣泛參與一系列生命活動的調控，包括細胞增殖和分化、細胞凋亡、器官形成和發育、脂肪代謝等[5]。研究發現，microRNA在SONFH患者壞死骨組織中異常表達[6]，說明microRNA參與其病理過程，可作為SONFH的生物學標記物，但其在血漿中的表達情況少見報道。本研究通過microRNA芯片技術篩選出SONFH患者血漿中異常表達的microRNA，并對其生物信息學內容進行分析。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2014年7月～2015年2月廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節科收治的SONFH患者6例作為觀察組，其中男2例、女4例，年齡26～37歲，發病時間9～34個月、平均23.2個月；原發病為濕疹1例、系統性紅斑狼瘡4例、銀屑病1例。納入標準：①符合ONFH診斷標準[7]；②有明確的長期大量糖皮質激素應用史；③原發病治愈或處于穩定期。排除標準：①原發病尚未得到有效控制或處于疾病活動期；②伴隨長期大量飲酒史或既往股骨頭、股骨頸創傷史。選取同期廣州中醫藥大學在校健康志愿者6例作為對照組，其中男5例、女1例，年齡23～35歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究均獲得受試者的知情同意，并通過廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會倫理審查。

1.2血漿中異常表達microRNA的篩選

1.2.1材料Nuclease free water、miRNA PCR ARRAY、SYBRTMGreen master mix(Exiqon公司，丹麥)，cDNA模板、ROX (Invitrogen公司，美國)，Gene Amp PCR System 7900(ABI公司，美國)，紫外分光光度計(Thermo Scientific公司，美國)，緩沖液(Reaction Buffer Exiqon公司，丹麥)。

1.2.2RNA提取及質量檢測兩組采用一次性真空EDTA抗凝采血管采集靜脈血約6 mL，4 ℃、2 000 g離心10 min，取上層血漿。將血漿轉移至滅菌2 mL EP管中，-80 ℃超低溫冰箱凍存備用。樣品化凍后3 000 g離心5 min，轉移上清至新的1.5 mL EP管中，加入TRIzol-LS試劑750 μL，劇烈震蕩5 s，根據TRIzol試驗步驟進行RNA沉淀、清洗、再溶解、沉淀及抽提，得到總RNA。采用NanoDrop? ND-1000微量紫外分光光度計進行紫外分光，總RNA蛋白A260/A280為1.48～1.62視為合格。

1.2.3microRNA相對表達量檢測采用Real-time PCR法。按照miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM試劑盒說明書進行操作：將試劑置于冰上于室溫下融化，取微量離心管，用移液器取1.0 μg RNA樣品，加入3.0 μL去RNA酶水稀釋，加入0.5 μL緩沖液充分混合。將混合液離心，置于42 ℃溫育60 min，于95 ℃溫育5 min以失活逆轉錄酶，完成cDNA逆轉錄。合成的cDNA移入硅化的tube管中備用。將制備的cDNA模板、nuclease-free 水和SYBRTMGreen master mix置于冰上溶解15～20 min。將反應獲得的cDNA模板用nuclease-free 水稀釋110倍，與Greenmaster mix充分混合，加入miRNA PCR ARRAY。PCR反應條件: 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 個循環，降溫速度1.6 ℃/s。每孔重復3 次，取平均Ct 值。選取hsa-miR-423-5p為內參，試驗重復3次，取平均值。基因相對表達量以2-ΔΔCt表示。以相對表達量觀察組/對照組>2且P<0.05為顯著上調，觀察組/對照組<0.7且P<0.05為顯著下調。

1.3差異表達microRNA的生物信息分析通過TargetScan、mirBase及miRanda三個在線數據庫預測差異表達microRNA的靶基因，TargetScan采用保守microRNA家族的保守位點、mirBase采用哺乳動物、miRanda采用mirSVR分值不超過-0.1的保守microRNA進行預測。選取三個在線數據庫預測的交集靶基因，分別進行功能富集性分析和信號轉導通路富集(Pathway)分析。

2結果

2.1兩組microRNA差異表達情況本研究共檢測了768個microRNA，兩組差異表達microRNA共16個。上調的10個microRNA中，觀察組與對照組hsa-miR-424-5p相對表達量分別為0.000 9±0.000 1、0.000 5±0.000 3，hsa-miR-31-5p分別為0.001 9±0.001 0、0.000 9±0.001 3，hsa-miR-190b分別為0.000 9±0.003 9、0.000 5±0.002 1，觀察組/對照組分別為1.97、1.96、1.68，P均<0.05；其余7個microRNA均顯著上調，其中hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-887相對表達量觀察組/對照組>3，見表1。下調的6個microRNA中，4個microRNA(hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-624-5p)顯著下調，其中hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p下調比較明顯(觀察組/對照組<0.5)，見表2。

表1　SONFH患者血漿顯著上調的microRNA(相對表達量，±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2　SONFH患者血漿下調的microRNA(相對表達量，

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。2.2差異表達microRNA的生物信息分析結果三個在線數據庫共篩選出交集靶基因887個，其中上調microRNA 483個，hsa-miR-1207-5未檢出交集靶基因，hsa-miR-887檢出交集靶基因為GSK3A和CASK；下調microRNA 404個，hsa-miR-96-5p檢出交集靶基因114個，hsa-miR-576-5p檢出59個。功能富集性分析顯示，兩組差異表達microRNA調控的靶基因功能主要包括：解剖結構形態、間充質細胞增殖、細胞代謝過程、細胞內信號轉導、系統發生、質膜蛋白質的定位、解剖結構的發展、神經系統發育、質膜組織；Pathway分析顯示，靶基因明顯富集于各種信號通路：肌動蛋白細胞調控通路、胰島素信號通路、鈣離子信使通路、雌激素受體信號轉導通路、促性腺激素信號通路等。

3討論

microRNA能夠穩定存在于外周血中，具有耐RNA 酶的特點，在血漿中結構比較穩定，不易被降解。通過對差異表達microRNA的研究及靶基因功能、信號通路的預測，可以揭示疾病的發生、發展機制，并將特異性microRNA作為疾病的標記物[8～10]。目前血漿microRNA在骨科領域的研究重點為骨腫瘤，在SONFH中的研究較少[11]。SONFH的發病機制目前尚不明確，但普遍認為是由于應用糖皮質激素后引起骨內穩態失衡、細胞損傷，致使局部供血障礙，最終導致ONFH[12]。研究證實，大量使用糖皮質激素可以導致細胞凋亡，從而引起SONFH[13]。在美國，每年有10 000～20 000人因服用糖皮質激素導致ONFH而需進行人工髖關節置換，占據了美國人工髖關節置換數量的10%[14]。因此，研究SONFH患者血漿中的microRNA表達譜變化，探索其靶基因與生物學功能，對SONFH的診斷與治療有重要意義。

本研究發現，SONFH患者血漿中有16 個microRNA 表達與正常人有顯著差異，上調的microRNA有10個，其中上調2倍以上的有7個，上調3倍以上的是hsa-miR-887、hsa-miR-1207-5p；下調的有6個，hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p下調比較明顯(觀察組/對照組<0.5)。 hsa-miR-1207-5p是從8q24染色體的PVT1基因進行轉錄[15]，PVT1在糖尿病腎病、乳腺癌、結腸癌、淋巴瘤等疾病中均有特異表達[16]。hsa-miR-96-5p作用位點在7#染色體，能夠顯著抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲[17]。hsa-miR-887、hsa-miR-576-5p在疾病差異表達microRNA中尚無報道，因此本研究是首次在SONFH患者血漿中發現差異表達的hsa-miR-887、hsa-miR-576-5p，其可能成為SONFH診斷、治療的新目標。本研究中SONFH患者血漿hsa-miR-15b-3p表達顯著上調。hsa-miR-15b-3p屬于hsa-miR-15家族，在細胞凋亡過程中具有重要作用。Bcl-2是hsa-miR-15的直接作用靶點，其上調可降低Bcl-2水平，還可以誘導SGC7901/VCR細胞凋亡[18]。因此，hsa-miR-15b-3p表達上調而誘導細胞凋亡程序啟動可能與SONFH的發病有關。

本研究對靶基因進行生物信息分析，結果發現hsa-miR-887對應交集靶基因為GSK3A和CASK，主要調控解剖結構形態；hsa-miR-96-5p檢出交集靶基因114個、hsa-miR-576-5p檢出59個，主要調控間充質細胞增殖、細胞代謝過程、細胞內信號轉導等生物學過程；Pathway分析顯示，靶基因明顯富集于各種信號通路。吳興凈等[19]對SONFH患者的壞死區骨組織microRNA進行檢測，發現靶基因功能涉及信號轉導、轉錄調控。由此可見，SONFH患者血漿差異表達的microRNA可能通過對靶基因的調控影響分子信號的轉導和基因轉錄過程，從而引起SONFH。

綜上所述，SONFH患者血漿microRNA上調明顯的是hsa-miR-1207-5p和hsa-miR-887，下調明顯的是hsa-miR-96-5p、hsa-miR-576-5p，microRNA異常表達可能通過各信號通路參與SONFH的發病。目前關于SONFH患者血漿microRNA差異表達的研究較少，大多數血漿microRNA的功能和作用機制尚不十分明確，同時血漿中microRNA作用的發揮受內環境影響，在骨細胞和外周循環中的作用可能并不相同。本研究為進一步研究SONFH的發病提供了依據，但差異表達microRNA的調控機制尚不明確，仍需進一步研究。

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·論著·

Bioinformatic analysis of miRNA expression profile in plasma of patients with

steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

SUNNan1,FANYue-guang,LIPeng-fei,ZENGYi-rong,ZENGJian-chun

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the changes of plasma microRNA expression profile and the content of bioinformatics in patients with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (SONFH) and to explore its significance. MethodsSONFH patients (observation group) and healthy volunteers (control group) were selected with 6 cases in each group. The real-time PCR was used to detect the relative expression of microRNA in the plasma to screen the differential expression of microRNA. TargetScan, mirBase and miRanda databases were used to predict the target genes which were analyzed by gene ontology (GO) and signal transduction pathway analysis. ResultsTotally 768 microRNAs were detected by microRNA chip detection. Sixteen microRNAs were different and significant in plasma of SONFH patients. Compared with the control group, 10 were up-regulated (significantly: hsa-miR-1207-5p and hsa-miR-887), and 6 were down-regulated (significantly: hsa-miR-96-5p and hsa-miR-576-5p). Totally 887 target genes were screened for the intersection by using TargetScan, mirBase and miRanda three databases. During which, 483 genes were up-regulated, 404 were down-regulated. No target genes of hsa-miR-1207-5p were detected, and the target genes of hsa-miR-887 were GSK3A and CASK. Totally 404 microRNAs were down-regulated, 114 Hsa-miR-96-5p-related target genes and 59 hsa-miR-576-5p-related target genes were found. GO and pathway analysis revealed that some differential expression of microRNAs, along with their target genes, were found to be involved in anatomical structure morphogenesis, mesenchymal cell proliferation, positive regulation of metabolic process and significantly enriched in the signal pathway. ConclusionsIn the plasma of SONFH patients, hsa-miR-1207-5p and hsa-miR-887 were significantly up-regulated, and hsa-miR-96-5p and hsa-miR-576-5p were significantly down-regulated. The abnormal expression of microRNAs in plasma of patients may be involved in the pathogenesis of SONFH through various signal pathways.

Key words:osteonecrosis of the femoral head; glucocorticoids; microRNA; gene expression profiling

收稿日期：(2015-11-10)

中圖分類號：R681.8

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)48-0001-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.001

通信作者簡介：樊粵光(1954-)，男，教授，研究方向為髖膝關節疾病，曾獲中華中醫藥學會科學技術二等獎。E-mail: 925324600@qq.com

作者簡介：第一孫楠(1986-)，男，博士研究生，研究方向為髖膝關節疾病。E-mail: sunnan.524@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81373652)。