PI3K/Akt和MAPK信號通路在缺血性腦損傷中的保護作用

郁　迪(綜述)，莫緒明(審校)

(南京醫科大學附屬南京兒童醫院心胸外科,南京 210008)

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PI3K/Akt和MAPK信號通路在缺血性腦損傷中的保護作用

郁迪△(綜述)，莫緒明※(審校)

(南京醫科大學附屬南京兒童醫院心胸外科,南京 210008)

摘要：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞內重要的信號轉導通路。研究發現PI3K/Akt和MAPK信號通路經下游多種靶點，即內皮型一氧化氮合酶、糖原合成酶激酶3、核因子κB、細胞外信號調劑激酶等促進腦缺血后神經細胞的存活PI3K/Akt和MAPK這兩條信號通路在缺血性腦損傷中發揮重要的作用，在一定條件下，這兩條信號通路的激活可以通過上述途徑有效抑制神經元細胞的凋亡而發揮腦保護的作用。

關鍵詞：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B；絲裂原活化蛋白激酶；腦保護；腦缺血；凋亡

深低溫低流量體外轉流方法是在深低溫下保持一定的流量灌注以避免大腦處于持續缺血狀態。這樣既保證了大腦最低的氧代謝需求，防止腦細胞酸中毒；又能提供較清晰的手術視野，不影響復雜先天性心臟病的手術操作。由于深低溫低流量本質上也是一個對大腦供血減少的過程，不可避免地會有缺血性腦損傷的存在，因此對于缺血性腦損傷的保護非常重要。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路是細胞內重要的信號轉導通路，通過影響下游多個靶點而發揮抑制凋亡、促進增殖的作用。大量研究發現，其在腦缺血保護中也有重要作用[1-4]。現就PI3K/Akt和MAPK兩條信號通路在缺血性腦損傷中抗凋亡作用的研究進展作一綜述。

1PI3K/Akt信號通路

PI3K家族成員屬于原癌基因，PI3K是由催化亞基p110和調節亞基p85構成的異源性二聚體。PI3K是一種可使肌醇環第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,激活后可磷酸化細胞膜上的肌醇,生成磷脂酰肌醇-3-磷酸、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。后兩者通過與Akt的PH區結合,部分激活Akt,并使其轉位于細胞膜的內表面。磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸可激活位于細胞膜內表面的磷脂酰激酶依賴激酶1、2，并進一步活化Akt。Akt可使絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化，故又稱Ser/Thr激酶?？苫罨喾N下游途徑，如內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、核因子κB、Bad、caspase-9等，成為重要的抗凋亡因子。PI3K/Akt通路通過抑制細胞凋亡，使細胞存活，在缺血性腦損傷的保護中發揮重要作用。PI3K/Akt通路的具體機制如下。

1.1Akt/caspase途徑caspase家族在介導細胞凋亡中起重要作用，主要有兩種不同的途徑：一種為caspase-8與CD95或腫瘤壞死因子受體1結合后介導的外源性途徑；另一種為線粒體起始的內源性途徑。細胞應激反應或凋亡信號能引起線粒體細胞色素C的釋放，作為凋亡誘導因子，細胞色素C能與凋亡酶激活因子1、caspase-9前體、腺嘌呤核糖核苷酸/腺嘌呤脫氧核糖核苷酸形成凋亡體，然后召集并激活caspase-3，進而引起caspase級聯反應，導致細胞凋亡[5]。細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中是線粒體介導的內源性凋亡途徑的關鍵性步驟，而caspase-9的活化是該級聯反應中的起始步驟。Akt促進細胞存活主要通過干預細胞凋亡級聯反應的上游細胞色素C的釋放,Akt能穩定線粒體的通透性轉換孔以及抑制Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道，從而抑制細胞色素C從線粒體的釋放[6-7]。并且活化的Akt使caspase-9在Ser196位點磷酸化而失活，從而抑制caspase-3等下游分子引起的一系列級聯反應，達到抑制凋亡的目的。何曉敏等[8]研究也發現，通過抑制線粒體細胞色素C的釋放可以發揮腦保護的作用。

1.2Akt/Bcl-2途徑Bcl-2家族的表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一，在細胞凋亡信號轉導途徑中發揮重要作用。根據其在細胞凋亡調控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白，主要包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Mcl-1等；另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bcl-x(s)和Bad等。缺血/缺氧刺激后可以激活PI3K，活化的PI3K激活Akt的磷酸化，活化的Akt使Bad在Ser136磷酸化，產生一個能與伴侶蛋白14-3-3結合的位點而形成復合物，一旦與伴侶蛋白14-3-3形成復合物后，Bad就從與Bcl-2或者Bcl-xL形成的異源二聚體中分離，使胞質中游離的Bcl-2或者Bcl-xL表達增加，而發揮抗凋亡作用[9-10]。同時活化的Akt可以上調Bcl-2的表達及下調Bax的表達，而發揮腦保護的作用[11]。通過基因剔除Akt小鼠的研究發現，缺血時Akt的磷酸化水平降低，使胞質中Bcl-2的表達下調而Bax的表達上調，促進腦細胞凋亡，腦損害加重[1]。

1.3Akt/GSK-3β途徑GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，GSK-3β高度表達于中樞神經系統并具有神經系統特異性，在促凋亡和促炎癥反應中起重要作用。GSK-3β在細胞內活性受雙位點磷酸化調控，在酪氨酸(Tyr)216磷酸化激活，GSK-3β在Tyr216去磷酸化或者在Ser9磷酸化而失活。在缺血刺激后，Akt首先通過Ser473磷酸化而激活，激活的Akt通過GSK-3βSer9的磷酸化而負性調節其活性，失活的GSK-3β可使環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element- binding protein,CREB)磷酸化而激活，活化的CREB可以調控一些生存因子的轉錄，如腦源性神經營養因子，從而減輕細胞凋亡[12]。研究發現，雌激素可以通過PI3K/Akt信號通路，增加缺血后腦組織中GSK-3β的磷酸化，而發揮抗凋亡作用[2]。

1.4Akt/叉頭途徑叉頭轉錄因子家族成員的4個亞型(FKHR/FoxO1、FoxO2、FKHRL1/FoxO3和AFX/FoxO4)均能被Akt直接磷酸化，磷酸化的插頭蛋白可以調控其靶基因促進細胞存活。生存因子可以活化PI3K/Akt途徑，激活的Akt進入細胞核使FKHRL1/FoxO3在Thr32和Ser253分別磷酸化，磷酸化的FKHRL1/FoxO3從胞核轉位入胞質，并與伴侶蛋白14-3-3結合而存留在胞質中，抑制Bim(Bcl-2家族促凋亡蛋白中的一種)的表達和促進Bcl-6(可以負性調控抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達)的表達[13-14]。同時活化的Akt可以磷酸化插頭轉錄因子，磷酸化的插頭轉錄因子與14-3-3蛋白結合，不能轉位進入細胞核而停留在胞質中，從而抑制Fas的活化和caspase級聯反應的激活[15]。

1.5 Akt/核因子κB途徑核因子κB在胞質中與抑制性卡巴蛋白形成無活性的復合物。活化的PI3K/Akt使抑制核因子κB激酶Thr 23磷酸化,從而激活核因子κB激酶，活化的核因子κB激酶又使核因子κB抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)磷酸化，磷酸化的IκB使IκB和核因子κB形成的復合物構象發生改變，隨后IκB從核因子κB上脫落，從而使核因子κB由抑制狀態被激活，并通過轉位進入細胞核，與DNA結合，啟動有關抗凋亡基因的轉錄，如Bcl-2、Bcl-xL[16]、凋亡蛋白抑制因子和X性染色體連鎖的凋亡蛋白抑制因子[17]。其中，Bcl-2和Bcl-xL可以抑制線粒體細胞色素C的釋放，而凋亡蛋白抑制因子可以特異性地抑制caspase-3/7/9的活化而發揮抗凋亡效應。

1.6Akt/eNOS途徑缺血/缺氧刺激后PI3K被激活，活化的PI3K導致Akt的磷酸化和eNOS的磷酸化，磷酸化的eNOS產生一氧化氮，而后者可以刺激鳥苷酸環化酶產生環磷酸鳥苷，高濃度的環磷酸鳥苷激活蛋白激酶G，最終導致線粒體ATP敏感性鉀通道在線粒體內膜上的開放[18]。研究發現，預先給予線粒體ATP敏感性鉀通道開放劑二氮嗪能顯著降低細胞色素C和caspase-3蛋白水平，從而抑制線粒體凋亡通路，發揮腦保護作用[19]。

2MAPK信號通路

MAPK是細胞內的一類Ser/Thr激酶，在哺乳動物中已發現和克隆了細胞外信號調節激酶(extracellular signal regutated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-term inal kinase,JNK)/應激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)、p38/SAPK2和大絲裂素活化蛋白激酶14個MAPK亞族。每個MAPK亞家族由幾種亞型和成員組成，且往往具有不同的功能。目前發現存在著多條并行的MAPK通路，不同的細胞外刺激可以激活不同的MAPK信號通路。

2.1ERK1/2通路生長因子與細胞膜上的受體酪氨酸激酶結合后，將信號傳給Ras，Ras發生膜轉位并激活Ser/Thr激酶Raf，后者是蛋白酪氨酸激酶受體信號轉導的中心，活化的Raf通過磷酸化mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2)上的兩個調節性Ser位點來激活MEK；MEK可以使Ser/Thr和Tyr磷酸化，最終高度選擇性地激活ERK1/2，形成經典的Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號轉導通路。ERK1/2活化后，作用于其主要的靶蛋白pp90核糖體S6激酶，后者可使Bad的Ser112磷酸化，磷酸化的Bad從與Bcl-2或Bcl-xL形成的異源二聚體中分離，并與伴侶蛋白14-3-3結合而失活[20]；同時Rsks也可使CREB在Ser133磷酸化，活化的CREB形成二聚體，募集CREB并與Bcl-2基因上的環磷酸腺苷反應元件結合，促進Bcl-2的轉錄[21-22]。通過這兩條途徑使Bcl-2家族中抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比值增加，而發揮抗凋亡效應。

2.2JNK/SAPK通路混合連接激酶(mixed-lineage kinases,MLKs)、mitogen-actiated protein kinases kinases kinases(MEKKs)、凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)以及轉化生長因子β激活性激酶1(transforming-growth factor β-activated kinase 1,TAK1)都可以磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinases,MKKs)，即MKK4/7，而后者又高度特異性地激活JNK/SAPK。激活后的JNK進一步使核內的轉錄因子c-Jun的Ser63和Ser73磷酸化，進而激活c-Jun而增強其轉錄活性。此外，JNK/SAPK激活后還可以使轉錄因子Elk-1(Ser383和Ser389)和活化轉錄因子2(Thr69和Thr71)發生磷酸化，并使其轉錄活性增強。c-Jun、c-Fos、Elk-1和活化轉錄因子2以同或異二聚體的形式和許多基因啟動子上的AP-1和AP-1樣位點結合，提高AP-1的轉錄活性，促進基因的表達和蛋白質的合成。Dong等[23]發現，缺血損傷可以通過JNK/c-Jun/AP-1的通路使腦細胞中14-3-3γ的水平提高，而后者又可與磷酸化的Bad特異性結合以抑制其促凋亡的作用[24]。而Wang等[25]發現，MLK/MKK/JNK途徑使JNK活化，激活的JNK可以促進Bcl-2和14-3-3蛋白的磷酸化，使Bax從Bax/Bcl-2及Bax/14-3-3的異源二聚體中游離，從而介導線粒體細胞色素C的釋放，引起凋亡。

2.3p38MAPK通路激活p38的磷酸化級聯反應與經典的MAPK的三級激酶反應相同，即細胞外信號啟動細胞內的一系列反應(MLK3、MEKK4、ASK1和TAK1)，最終導致雙位點特異激酶MEK/MKK(MEK3/6)磷酸化鄰近的Tyr與Thr，激活p38MAPK通路。p38有4個同型異構體：p38α、p38β、p38γ和p38δ,在腦組織中僅有p38α和p38β的表達。研究表明，p38α可以通過與轉化生長因子β激活的蛋白激酶1結合蛋白相互作用并自我磷酸化而激活[26]。活化的p38磷酸化并同時激活絲裂原和應激活化蛋白激酶1及絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2，后兩者可以進一步使CREB Ser133磷酸化，活化的CREB與Bcl-2基因上的環磷酸腺苷反應元件結合，促進Bcl-2的轉錄，而發揮抗凋亡效應?；罨膒38 MAPK還可激活轉錄因子活化轉錄因子2及Elk-1，使其與CREB共同作用促進即刻早期基因轉錄增加，如c-fos。而c-fos在缺血性腦損傷中的作用還存在爭議，部分學者認為c-fos基因在腦缺血過程中的表達可以上調神經生長因子基因的表達，從而發揮對神經細胞的保護作用，如張志琴等[27]研究發現c-fos對神經細胞的保護作用可能是通過對Bcl-2家族蛋白的間接調控而發揮作用。另有學者認為，c-fos的高度表達阻斷了細胞內信號的轉導，并產生死亡因子，最終導致缺血后神經細胞凋亡，如Hattori等[28]研究發現，抑制c-fos的表達，可部分阻斷細胞凋亡，也驗證了這一結果。c-fos基因的表達具有雙重效應，它既參與對受損神經細胞的保護作用，又介導和誘導神經細胞凋亡。而c-fos表達發揮哪種效應，可能取決于細胞所處的內外環境、c-fos表達的數量及某些尚未發現的決定性因素。

3結語

隨著復雜先天性心臟病手術的廣泛開展，運用深低溫低流量體外循環方法的手術不斷增加，因此缺血性腦損傷的發生也隨之增加。腦缺血損傷后，可以激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，PI3K/Akt和MAPK信號通路之間存在著廣泛的相互作用，在腦缺血性損傷的保護中不可能僅通過一條通路來達到腦保護的效果；并且在同一條通路中，也同時存在著促凋亡和抗凋亡兩種不同的效應。因此如何在抗凋亡和促凋亡之間達到一個平衡點，并發揮腦保護的作用，仍然有待進一步的研究。

參考文獻

[1]馬志飛,莫緒明,楊中洲,等.PI3K/Akt在深低溫低流量腦保護中的作用[J].中華實驗外科雜志,2010,27(7):933-935.

[2]Jover-Mengual T,Miyawaki T,Latuszek A,etal.Acute estradiol protects CA1 neurons from ischemia-induced apoptotic cell death via the PI3K/Akt pathway[J].Brain Res,2010,1321:1-12.

[3]Cui L,Zhang X,Yang R,etal.Neuroprotection of early and short-time applying atorvastatin in the acute phase of cerebral ischemia: down-regulated 12/15-LOX,p38MAPK and cPLA2 expression,ameliorated BBB permeability[J].Brain Res,2010,1325:164-173.

[4]Shi GX,Andres DA,Cai W.Ras family small GTPase-mediated neuroprotective signaling in stroke[J].Cent Nerv Syst Agents Med Chem,2011,11(2):114-137.

[5]Riedl SJ,Salvesen GS.The apoptosome:signalling platform of cell death[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(5):405-413.

[6]Kroemer G.Reed JC.Mitochondrial control of cell death[J].Nat Med,2000,6(5):513-519.

[7]Harris MH,Thompson CB.The role of the Bcl-2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability[J].Cell Death Differ,2000,7(12):1182-1191.

[8]何曉敏,莫緒明,顧群,等.二氮嗪預處理對幼齡大鼠深低溫腦缺血/再灌注損傷的影響[J].江蘇醫藥,2008,34(3):248-251.

[9]Datta SR,Dudek H,Tao X,etal.Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery[J].Cell,1997,91(2):231-241.

[10]Zha J,Harada H,Yang E,etal.Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L)[J].Cell,1996,87(4):619-628.

[11]Wang CH,Wang ZH,Zhang XJ,etal.Protection by silibinin against experimental ischemic stroke:Up-regulated pAkt,pmTOR,HIF-1α and Bcl-2,down-regulated Bax,NF-κB expression[J].Neurosci Lett,2012,529(1):45-50.

[12]Li D,Qu Y,Mao M,etal.Involvement of the PTEN-AKT-FOXO3a pathway in neuronal apoptosis in developing rat brain after hypoxia-ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(12):1903-1913.

[13]Zhang X,Zhang X,Wang C,etal.Neuroprotection of early and short-time applying berberine in the acute phase of cerebral ischemia:Up-regulated pAkt,pGSK and pCREB,down-regulated NF-κB expression,ameliorated BBB permeability[J].Brain Res,2012,1459:61-70.

[14]Burgering BM,Medema RH.Decisions on life and death:FOXO Forkhead transcription factors are in command when Akt/PKB is off duty[J].J Leukoc Biol,2003,73(6):689-701.

[15]Koh PO.Melatonin prevents the injury-induced decline of Akt/forkhead transcription factors phosphorylation[J].J Pineal Res,2008,45(2):199-203.

[16]Dhandapani KM,Wade FM,Wakade C,etal.Neuroprotection by stem cell factor in rat cortical neurons involves AKT and NFkappaB[J].J Neurochem,2005,95(1):9-19.

[17]Chong ZZ,Li F,Maiese K.Oxidative stress in the brain:Novel cellular targets that govern survival during neurodegenerative disease[J].Prog Neurobiol,2005,75(3):207-246.

[18]Costa AD,Garlid KD,West IC,etal.Protein kinase G transmits the cardioprotective signal from cytosol to mitochondria[J].Circ Res,2005,97(4):329-336.

[19]何曉敏,莫緒明,顧群,等.二氮嗪對幼齡大鼠深低溫腦缺血再灌注后氧自由基及細胞凋亡的影響[J].中華外科雜志,2010,48(2):142-145.

[20]Bonni A,Brunet A,West AE,etal.Cell Survival Promoted by the Ras-MAPK Signaling Pathway by Transcription-Dependent and -Independent Mechanisms[J].Science,1999,286(5443):1358-1362.

[21]Meller R,Minami M,Cameron JA,er al.CREB-mediated Bcl-2 protein expression after ischemic preconditioning[J].J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(2):234-246.

[22]Carlezon WA Jr,Duman RS,Nestler EJ.The many faces of CREB[J].Trends Neurosci,2005,28(8):436-445.

[23]Dong Y,Liu HD,Zhao R,etal.Ischemia activaties JNK/c-Jun/AP-1 pathway to up-regulate 14-3-3γ in astrocyt[J].J Neurochem,2009,109(1):182-188.

[24]Chen XQ,Fung YW,Yu AC.Association of 14-3-3gamma and phosphorylated bad attenuates injury in ischemic astrocyte[J].J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(3):338-347.

[25]Wang Q,Yin XH,Liu Y,etal.K252a suppresses neuronal cells apoptosis through inhibiting the translocation of Bax to mitochondria induced by the MLK3/JNK signaling after transient global brain ischemia in rat hippocampal CA1 subregion[J].J Recept Signal Transduct Res,2011,31(4):307-313.

[26]Ge B,Gram H,Di Padova F,etal.MAPKK-independent activation of p38alpha mediated by TAB1-dependent autophosphorylation of p38alpha[J].Science,2002,295(5558):1291-1294.

[27]張志琴,張晗,劉政江,等.海馬缺血神經元反義c-fos寡核苷酸對bcl-2、bax蛋白表達影響[J].陜西醫學雜志,2004,33(4):308-311.

[28]Hattori Y,Watanabe M,Iwabe T,etal.Administration of MK801 decreases c-Fos expression in the trigeminal sensory nuclear complex but increases it in the midbrain during experimental movement of rat molars[J].Brain Res,2004,1021(2):183-191.

Study on the Protection Effects of PI3K/Akt and MAPK Signal Pathways in Ischemic Brain InjuryYUDi,MOXu-ming. (DepartmentofCardiothoracicSurgery,NanjingChildren′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

Abstract:Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B(PI3K/Akt) and mitogen-activated protein kinases(MAPK) signal pathways are important intracellular signaling transduction pathways.It has been reported that both of them could activate downstream targets,namely,endothelial nitric oxide synthase,glycogen synthase kinase3,nuclear factor-κB,extracellular signal regutated kinase,et al.to make the neurons survive after ischemia brain injury.Therefore,such findings indicate that PI3K/Akt and MAPK signal pathways play critical roles in ischemia brain injury.Under certain circumstances,activation of these two pathways can effectively inhibit apoptosis of neuronal cells through the above ways and play a protective role in ischemia brain injury.

Key words:Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B; Mitogen-activated protein kinases; Cerebral protection; Cerebral ischemia; Apoptosis

收稿日期：2014-02-17修回日期：2014-07-08編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.007

中圖分類號：R742

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)02-0210-04