RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展

曹大龍(綜述)，劉黎明(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 蚌埠 233000)

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RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展

曹大龍△(綜述)，劉黎明※(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 蚌埠 233000)

摘要：RNA干擾(RNAi)技術(shù)是利用雙鏈RNA，高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA，從而阻斷特定基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。與反義寡聚核苷酸技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有更高的特異性，是更有效的方法。目前，RNAi技術(shù)是腫瘤基因治療領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)技術(shù)，它抑制癌基因表達(dá)及腫瘤血管生成，沉默細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及腫瘤耐藥相關(guān)基因，在腫瘤基因治療領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:腫瘤；RNA干擾技術(shù)；小干擾RNA；治療

腫瘤是多基因、多因素、多階段疾病相互作用的結(jié)果。現(xiàn)在臨床上對(duì)于惡性腫瘤所應(yīng)用的方法，如放、化療已經(jīng)到達(dá)一個(gè)瓶頸階段，效果沒(méi)有突破性的進(jìn)展，只能起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。并且，化療藥物的不良反應(yīng)比較大，有些患者由于腫瘤影響，體質(zhì)較差，免疫力非常弱，放、化療的不良反應(yīng)可能會(huì)讓患者更受折磨。RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)對(duì)于內(nèi)源性基因和外源性基因均有明顯的沉默作用[1]，可以抑制腫瘤多個(gè)不同的基因，而且抑制作用互不影響，為多基因、多因素、多階段疾病相互作用引起的腫瘤的治療提供了可能。此外，RNAi引起的是轉(zhuǎn)錄后特異的基因沉默，導(dǎo)致與雙鏈RNA序列同源的信使RNA(messenger RNA,mRNA)降解[2]，因而避免了對(duì)機(jī)體系統(tǒng)的不必要干擾，因此RNAi治療腫瘤具有高度靶向性、特異性和安全性。RNAi技術(shù)作為基因沉默研究的有力工具，在基因治療、制藥及基因研究中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)對(duì)RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1RNAi抑制癌基因的表達(dá)

RNAi技術(shù)應(yīng)用于治療腫瘤，對(duì)癌基因過(guò)表達(dá)的腫瘤，通過(guò)癌基因敲除的方法，抑制癌基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前的方法主要是關(guān)閉表達(dá)或使其產(chǎn)物失活。絲/蘇氨酸蛋白激酶基因是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，參與腫瘤的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和生存。絲/蘇氨酸蛋白激酶是一種致癌基因,在多種腫瘤中高表達(dá)[3]。絲/蘇氨酸蛋白激酶被證實(shí)是腫瘤基因治療的合適靶點(diǎn)。Zhang等[4]針對(duì)絲/蘇氨酸蛋白激酶基因?qū)⒁欢涡「蓴_RNA (small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染白血病患者的體外細(xì)胞，檢測(cè)出AKT基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)顯著下調(diào)。Slug基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，被證明是癌癥基因治療的理想靶點(diǎn)。Qian等[5]利用RNAi技術(shù)將人工合成的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)轉(zhuǎn)染結(jié)直腸細(xì)胞HCT116細(xì)胞株，抑制Slug基因的表達(dá)，顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)。潛伏膜聯(lián)蛋白2A在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在鼻咽癌細(xì)胞株和C666-1細(xì)胞株體外實(shí)驗(yàn)中，Ying等[6]利用RNAi技術(shù)，沉默潛伏膜聯(lián)蛋白2A基因，抑制其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制[7]。因此，可以通過(guò)RNAi技術(shù)沉默癌基因，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

肺癌細(xì)胞株H1650群旁細(xì)胞高表達(dá)膜聯(lián)蛋白A2和胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白，對(duì)傳統(tǒng)的化療方法產(chǎn)生耐藥。針對(duì)膜聯(lián)蛋白A2，Andey等[7]設(shè)計(jì)shRNA轉(zhuǎn)染H1650細(xì)胞，結(jié)果顯示膜聯(lián)蛋白A2基因的mRNA表達(dá)量顯著降低，蛋白表達(dá)下降約92%。進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA的小鼠，腫瘤質(zhì)量減少到以前的19%。

肺癌的組織和細(xì)胞系中尾肢同源蛋白2(pygopus homolog 2,Pygo2)基因高表達(dá)，而且Pygo2表達(dá)水平與胞質(zhì)中β聯(lián)蛋白水平有關(guān)。Zhou等[8]利用RNAi技術(shù)，使用shRNA敲除肺癌細(xì)胞中表達(dá)的Pygo2基因，檢測(cè)β聯(lián)蛋白水平和依賴(lài)性β聯(lián)蛋白/T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，表明Pygo2可以激活Wnt信號(hào)通路，并進(jìn)一步證實(shí)抑制Pygo2基因表達(dá)則抑制Wnt信號(hào)通路。同時(shí)檢測(cè)裸鼠移植瘤模型，Pygo2 shRNA抑制肺癌細(xì)胞增殖，因此推測(cè)，可以通過(guò)使用RNAi技術(shù)抑制Pygo2表達(dá)用于肺癌治療。

2RNAi抑制腫瘤血管生成

血管生成是腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制腫瘤血管生成則可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，因此，抑制腫瘤血管生成成為治療惡性腫瘤的一個(gè)有吸引力的靶標(biāo)。腫瘤血管形成依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，其結(jié)合于腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF受體。下調(diào)VEGF受體2表達(dá)的似乎是一個(gè)可行的選擇，以抑制腫瘤血管生成[9]。Ding等[10]將人工合成的siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，降低VEGF表達(dá)水平，抑制腫瘤內(nèi)微血管的形成。Hu等[11]通過(guò)RNAi技術(shù)，降低宮頸癌細(xì)胞中VEGF表達(dá)，結(jié)果顯示VEGF的表達(dá)顯著抑制，宮頸癌細(xì)胞凋亡率顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)抑制VEGF的表達(dá)可增強(qiáng)宮頸癌放療敏感性。Hobel等[12]在皮下腫瘤異種移植小鼠模型中，利用siRNA降低VEGF的表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，并且小鼠未變現(xiàn)出不良反應(yīng)。因此推測(cè)，可以通過(guò)RNAi技術(shù)抑制腫瘤血管生成，可進(jìn)一步達(dá)到治療腫瘤的目的。

3RNAi對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的沉默作用

細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如c-myc、抑癌基因p53等。它們既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。因此，利用RNAi技術(shù)沉默或下調(diào)腫瘤細(xì)胞中抗凋亡的基因或蛋白的表達(dá)，對(duì)腫瘤治療具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

Bcl-2蛋白是AKT下游抗凋亡Bcl-2家族中的一員，在許多腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高[13]，Liu和Lu[14]利用化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC823，沉默Bcl-2基因，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，使BGC823細(xì)胞凋亡率顯著下降，同時(shí)siRNA增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，存活蛋白在所有常見(jiàn)惡性腫瘤中表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、腎癌、黑色素癌、腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和卵巢癌等，而在正常組中無(wú)表達(dá)。因此，可通過(guò)RNAi沉默存活蛋白表達(dá)，抑制腫瘤抗凋亡作用，對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生有害影響。Liu等[15]將針對(duì)存活蛋白設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC7721中使用半定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)出存活蛋白的表達(dá)明顯抑制，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢。趙留芳等[16]設(shè)計(jì)合成存活蛋白靶向的shRNA，注射到鼻咽癌裸鼠移植瘤內(nèi)，小鼠腫瘤組織中存活蛋白表達(dá)明顯抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡增加，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，并未對(duì)小鼠的肝、腎產(chǎn)生不利影響。

p53蛋白是大家熟知的腫瘤抑制蛋白。人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞表達(dá)突變型p53蛋白具有抗凋亡作用。Braicu等[17]利用RNAi技術(shù)，抑制三陰乳腺癌人類(lèi)細(xì)胞株(Hs578T)中p53蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p53表達(dá)明顯下調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此認(rèn)為，RNAi可以作為有前途的治療三陰乳腺癌的策略。

4RNAi對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的沉默作用

RhoC蛋白GTP酶是Ras超家族小分子量G蛋白成員。近年來(lái)研究表明，RhoC蛋白參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，RhoC蛋白的過(guò)量表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。Wang等[19]設(shè)計(jì)針對(duì)RhoC的shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入體外細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)顯著抑制RhoC的mRNA和RhoC蛋白的表達(dá)；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1 (metastasis-associated 1,MTA1)與許多癌癥發(fā)生有關(guān)，并增加腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)細(xì)胞的潛力。Zhang等[20]利用化學(xué)合成的針對(duì)MTA1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞株HEP-2，結(jié)果表明，MTA1促進(jìn)HEP-2細(xì)胞的侵襲、黏附和遷移行為，RNAi技術(shù)顯著降低了MTA1的表達(dá)及癌癥細(xì)胞的惡性表型，抑制了喉癌的轉(zhuǎn)移及進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞絨毛蛋白(Ezrin)在多種腫瘤中高表達(dá)，且在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮重要作用[21]。高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞株高表達(dá)Ezrin mRNA和Ezrin蛋白，Li等[22]使用化學(xué)合成的shRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，成功沉默Ezrin表達(dá)，顯著抑制癌細(xì)胞生物學(xué)活性和侵襲性；Ezrin基因在骨肉瘤細(xì)胞株MG63高表達(dá)，Shang等[23]使用RNAi技術(shù)降低Ezrin表達(dá)，促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制MG63細(xì)胞的增殖；miRNA-183被認(rèn)為是一種抑制腫瘤的miRNA，在骨肉瘤的細(xì)胞和組織中，miRNA-183表達(dá)水平降低。Zhu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183的表達(dá)水平與骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)顯著相關(guān)；骨肉瘤中miRNA-183表達(dá)水平與Ezrin基因的mRNA和蛋白水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，正常表達(dá)水平中miRNA-183可下調(diào)Ezrin基因的表達(dá)，抑制骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，推測(cè)可通過(guò)RNAi技術(shù)，干擾腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。

5RNAi對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因的沉默作用

多藥耐藥性(multi drug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸某一化療藥物，產(chǎn)生的不僅對(duì)此種化療藥物耐藥性，而且可對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。這是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的最重要的防御機(jī)制，也是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。近年來(lái)，科學(xué)研究使用RNAi技術(shù)沉默腫瘤耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR，同時(shí)結(jié)合抗腫瘤化療藥物，對(duì)多藥耐藥腫瘤進(jìn)行治療。

5.1逆轉(zhuǎn)蛋白相關(guān)腫瘤耐藥腫瘤耐藥與多種因素有關(guān)，如MDR1基因及其編碼的P糖蛋白介導(dǎo)的耐藥，多藥耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥蛋白表達(dá)增加等。Tang等[25]發(fā)現(xiàn)在多重耐藥肝癌細(xì)胞株Bel/FU中，組蛋白賴(lài)氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)升高，采用RNAi技術(shù)沉默其表達(dá)，下調(diào)MDR1及其編碼的糖蛋白的表達(dá)，可促進(jìn)多耐藥腫瘤細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞阻滯在G1/S期。Zhao等[26]將化學(xué)合成的shRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BT-325，成功抑制了MDR1基因的轉(zhuǎn)錄和P糖蛋白的翻譯，增加了BT-325細(xì)胞對(duì)抗腫瘤化療的敏感性。Yin等[27]利用RNAi技術(shù)，分別針對(duì)MDR基因和存活蛋白基因合成兩個(gè)不同的shRNA，轉(zhuǎn)染到耐強(qiáng)力霉素的乳腺癌小鼠模型上，同時(shí)聯(lián)合強(qiáng)力霉素治療小鼠腫瘤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得小鼠腫瘤組織中P糖蛋白和存活蛋白水平顯著下調(diào)，小鼠腫瘤體積明顯縮小，小鼠病死率明顯下降。Wang等[28]利用人工合成的siRNA轉(zhuǎn)染人耐藥卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR8/ADR)中，有效地抑制P糖蛋白的表達(dá)，從而恢復(fù)OVCAR8/ADR的對(duì)腫瘤化療藥物敏感性。Chen等[29]利用RNAi技術(shù)，抑制肺癌細(xì)胞株801D的單絲氨酸蛋白激酶1基因表達(dá)和蛋白翻譯，抑制癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。為探討E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1,E2F-1)基因沉默對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP對(duì)順鉑敏感性的影響。廉超等[30]利用RNAi技術(shù)，沉默E2F-1基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E2F-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降。對(duì)順鉑的半數(shù)最大抑制濃度顯著降低，腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著提高，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,沉默E2F-1基因還有效提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。孔凡彪等[31]將針對(duì)E2F-1基因的慢病毒載體質(zhì)粒注射耐藥小鼠腫瘤組織內(nèi)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)于對(duì)照組小鼠，E2F-1沉默組的小鼠腫瘤組織中E2F-1基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)腫瘤的生長(zhǎng)速率顯著下降，腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著升高。

5.2逆轉(zhuǎn)凋亡基因相關(guān)腫瘤耐藥細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產(chǎn)生MDR[32]。Zhang等[33]構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染耐藥人類(lèi)骨肉瘤細(xì)胞株MG63，從而抑制細(xì)胞周期蛋白D1和Bcl-2的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)阿霉素化療的敏感性。高表達(dá)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)凋亡因子1可以增強(qiáng)乳腺癌對(duì)化療藥物的耐藥性，Wang等[34]通過(guò)RNAi沉默細(xì)胞因子誘導(dǎo)凋亡因子1在多藥耐藥乳腺癌裸鼠中的表達(dá)，同時(shí)結(jié)合化療藥物抗腫瘤治療，顯著抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。Zou等[35]將外源性siRNA轉(zhuǎn)染入肺癌細(xì)胞株H1975中，從而抑制Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，此外增強(qiáng)吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的促凋亡作用和逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)表皮因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性。

通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究顯示，RNAi技術(shù)可以降低甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，增加腫瘤對(duì)化療的效果，達(dá)到治療癌癥的目的，為人類(lèi)腫瘤治療提供新穎和有前途的解決方案。

6小結(jié)

RNAi技術(shù)在腫瘤治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景，目前，RNAi技術(shù)僅僅停留在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，存在諸多的問(wèn)題需要解決。首先，siRNA不僅與腫瘤靶基因特異性結(jié)合，還可與非靶基因結(jié)合而導(dǎo)致非靶基因沉默，這種現(xiàn)象稱(chēng)為siRNA的脫靶效應(yīng)(off-target effect)[36]。siRNA相關(guān)的脫靶效應(yīng)主要分為以下3類(lèi)：抑制非靶基因的表達(dá)、誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)、引起RNAi的飽和效應(yīng)。這種脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生嚴(yán)重影響RNAi的應(yīng)用，已成為RNAi技術(shù)腫瘤基因治療面臨的重要問(wèn)題。目前的解決方法是從siRNA的設(shè)計(jì)、特異性修飾等方面出發(fā)，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，尋找解決RNAi脫靶的方法，但這只是一種相對(duì)的方法；其次，siRNA可能與內(nèi)源性的微RNA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，使原本一些由miRNA調(diào)控的腫瘤基因表達(dá)失調(diào)，影響機(jī)體細(xì)胞的病理生理。再次，外源性RNA片段體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下，隨著納米轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)的不斷改進(jìn)，siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題將得到妥善解決。最后，RNAi在人體內(nèi)能否長(zhǎng)期存在并發(fā)揮作用，以及RNAi在人體內(nèi)的安全性等問(wèn)題，這也是值得考慮的。

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Research Progress of RNA Interference in Tumor Gene TherapyCAODa-long,LIULi-ming.(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China)

Abstract：RNA interference(RNAi) technology triggers the degradation of a homologous messenger RNA with high efficiency and specificity by double-stranded RNA,thus blocks the specific gene expression,and causes the cells lack of target genes phenotypic.Compared with the antisense oligonucleotide technology,RNAi technology has a higher specificity,and is a more effective method.Currently,RNAi technology is a hot technology in the field of tumor gene therapy,which inhibits the expression of oncogenes and tumor angiogenesis,silences apoptosis-related genes,tumor metastasis-related genes and tumor resistance-related genes.RNAi technology shows wide application prospects in the field of tumor gene therapy.

Key words:Tumor; RNA interference; Small interfering RNA; Therapy

收稿日期：2014-09-12修回日期：2014-12-03編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026

中圖分類(lèi)號(hào)：R73

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)14-2566-04