補體C3a促進人視網膜色素上皮細胞分泌血管內皮生長因子的研究

陽雪，曹曉光，龍琴

（1.中國醫學科學院北京協和醫院眼科，北京 100073；2.北京大學人民醫院眼科，北京 100044）

補體C3a促進人視網膜色素上皮細胞分泌血管內皮生長因子的研究

陽雪1，曹曉光2，龍琴1

（1.中國醫學科學院北京協和醫院眼科，北京 100073；2.北京大學人民醫院眼科，北京 100044）

目的觀察補體活化產物C3a對體外培養的人視網膜色素上皮細胞（RPE）分泌血管內皮生長因子（VEGF）的影響。方法采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）和半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）的方法，測定濃度0.1 μmol/L和0.3 μmol/L的重組人C3a干預RPE細胞24、48、72 h后VEGF蛋白和mRNA表達水平。結果0.1 μmol/L的C3a干預RPE細胞72 h后，VEGF蛋白表達高于干預48 h和24 h的水平，差異均有統計學意義（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE細胞24、48、72 h后，VEGF蛋白表達組間差異均有統計學意義（P＜0.01），具有正性時間—效應關系；0.1 μmol/L的C3a作用RPE細胞72 h后，VEGF mRNA表達高于48 h和24 h，差異有統計學意義（P＜0.05）；0.3 μmol/L的C3a作用RPE細胞72 h后，VEGF mRNA表達高于48 h和24 h，差異有統計學意義（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用72 h時VEGF的蛋白表達量高于0.1 μmol/L的C3a，差異有統計學意義（P＜0.01）；0.3 μmol/L的C3a作用24 h時VEGF mRNA表達量高于0.1 μmol/L的C3a，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論C3a可促進人RPE細胞VEGF的分泌，高濃度C3a對VEGF分泌的促進作用早于低濃度C3a，提示補體活化程度越強，對新生血管的促進作用則越迅速。

人視網膜色素上皮細胞；補體C3a；血管內皮生長因子

近年來，補體在脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）發生過程中的作用受到越來越多的關注［1，2］。補體系統活化所產生的多種裂解片段，尤其是C3a，與靶細胞表面受體結合，釋放炎性介質和細胞因子，成為補體依賴性反應的中心環節。研究表明，在年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）患者的玻璃膜疣和小鼠CNV模型局部均可見C3a表達顯著升高［3，4］，抑制C3a或C3a受體功能則可減輕動物模型中CNV的發生［4］。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）作為CNV啟動信號的產生者，可表達包括C3a在內的多種補體受體，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為機體內新生血管形成的強促進因子，在CNV的發生中起重要作用［5］，然而，C3a與VEGF的內在效應關系目前研究不足。因此，本研究擬通過觀察C3a刺激人RPE細胞中VEGF分泌的變化，探討C3a在CNV發生過程中可能存在的信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1 RPE細胞培養

人RPE細胞ARPE19細胞株由北京大學人民醫院眼科實驗室饋贈。RPE細胞培養參照文獻［6］。將凍存的RPE細胞復蘇后，置于37℃、5%CO2、濕度90%的培養箱中培養，采用含15%胎牛血清的DMEM+Ham′s F12培養基（F12）（1∶1）。當細胞接近融合時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA進行傳代。將生長良好的自復蘇開始傳代3次的RPE細胞計數后以4×105/孔的細胞密度接種于6孔培養板，培養48 h細胞達到70%融合后，用含2 mmol/mL谷氨酰胺的無血清培養基替換含血清培養基，培養24 h后棄去培養液進行干預實驗。

1.2 C3a干預實驗

采用重組人C3a（204881，Millipore公司，美國）進行RPE干預實驗，培養基為無血清DMEM+F12培養基。實驗組：RPE細胞培養液中加入含終濃度分別為0.1和0.3 μmol/L的C3a；對照組：RPE細胞培養基中不加C3a（終濃度為0 μmol/L）。培養24 h、48 h和72 h后，分別收集細胞上清液1 mL，置于-80℃保存待用，每種C3a濃度和時間點設4個平行孔。

1.3 RPE細胞分泌蛋白水平的檢測

采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法進行RPE細胞的VEGF蛋白分泌量檢測。參照VEGF試劑盒（ExCell Biology Inc.公司，中國上海）說明書進行操作。將各孔數值與其相同時間下空白對照孔數值的比值代表蛋白表達進行統計分析。

1.4 RPE細胞分泌mRNA水平的檢測

采用0.2 μmol/L C3a刺激RPE細胞48 h，以0 μmol/L C3a作為對照。收集各孔細胞，Trizol法提取細胞總RNA，進行逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR），2%瓊脂糖凝膠電泳，同時設立空白對照和GAPDH為內參照。應用凝膠圖像處理系統進行條帶灰度分析，VEGF和PEDF的灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值的比值代表其mRNA的表達參與統計分析。VEGF上游引物：5′TGCATTCACATTTG TTGTGCTGTAG 3′，下游引物5′GCAGATTATGCGG ATCAAACC 3′；GAPDH上游引物：5′TCACCATCT TCCAGGAGCGAG 3′，下游引物：5′TGTCGCTGTTG AAGTCAGAG 3′。

1.5 統計學分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 5軟件進行統計分析，總體差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。本研究測量指標的數據資料以表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C3a作用下RPE細胞刺激VEGF分泌的時間—效應關系

2.1.1 VEGF蛋白水平：濃度為0.1 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF蛋白表達的差異有統計學意義（F=6.56，P＜0.05），經組間比較發現，作用48 h與24 h VEGF蛋白表達無統計學差異（q=1.69，P＞0.05），作用72 h后VEGF蛋白表達分別是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差異均有統計學意義（72 h vs 48 h：q= 3.34，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=5.03，P＜0.01）。濃度為0.3 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF蛋白表達的差異有統計學意義（F=86.20，P＜0.01），經組間比較發現，作用24 h、48 h、72 h VEGF蛋白表達組間差異均有統計學意義（24 h vs 48 h：q=9.38，P＜0.01；24 h vs 72 h：q=18.57，P＜0.01；48 h vs 72 h：q=9.19，P＜0.01），作用72 h后VEGF蛋白表達分別是48 h和24 h的1.72倍和1.26倍。見表1，圖1。

2.1.2 VEGF核酸水平（RT-PCR）：濃度為0.1 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點VEGF mRNA表達的差異有統計學意義（F=10.89，P＜0.01），經組間比較發現，作用48 h與24 h后VEGF mRNA表達無統計學差異（q=2.34，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表達分別是48 h和24 h的1.13倍和1.22倍，差異有統計學意義（72 h vs 48 h：q=4.17，P＜0.05；72 h vs 24 h：q=6.51，P＜0.01）。濃度為0.3 μmol/L的C3a分別作用24 h、48 h、72 h后，各個時間點RPE細胞VEGF mRNA表達的差異有統計學意義（F=18.49，P＜0.01），經組間比較發現，48 h與24 h VEGF mRNA表達無統計學差異（q=0.40，P＞0.05），作用72 h后VEGF mRNA表達分別是48 h和24 h的1.23倍和1.25倍，差異有統計學意義（72 h vs 48 h：q=7.24，P＜0.01；72 h vs 24h：q=7.64，P＜0.01）。見表2，圖2。

表1 不同濃度C3a作用下VEGF蛋白表達水平Tab.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

圖1 C3a作用下RPE細胞分泌VEGF蛋白水平Fig.1 Protein level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

2.2 C3a干預RPE細胞分泌VEGF的劑量-效應關系

ELISA結果顯示：0.1 μmol/L與0.3 μmol/L的C3a作用24 h、48 h后，VEGF的蛋白表達水平無統計學差異（24 h：t=2.28，P＞0.05；48 h：t=1.59，P＞0.05），而0.3 μmol/L的C3a作用72 h后VEGF蛋白表達水平是0.1 μmol/L C3a作用下蛋白表達的1.20倍，差異有統計學意義（t=10.57，P＜0.01）。RTPCR結果顯示：0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表達水平是0.1 μmol/L C3a作用下的1.08倍，差異有統計學意義（t=1.19，P＜0.01），而0.1 μmol/L與0.3 μmol/L C3a作用48 h和72 h后VEGF mRNA表達水平無統計學差異（48 h：t=0.48，P＞0.05；72 h：t=7.42，P＞0.05）。

表2 不同濃度C3a作用下VEGF mRNA表達水平Tab.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

圖2 C3a作用下RPE細胞分泌VEGF mRNA水平Fig.2 mRNA level of VEGF affected by C3a at different concentrations and time points

3 討論

CNV是眼內新生血管的重要表現形式之一，常累及黃斑，造成出血、滲出和瘢痕形成，嚴重影響視功能，因此成為包括AMD、病理性近視、息肉樣脈絡膜血管病變等眼部疾病的主要致盲原因［7～9］。CNV形成的確切機制目前尚不清楚，其病理生理變化包括細胞外基質降解、血管內皮細胞增生和毛細血管管腔形成等過程，RPE細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞以及VEGF等促血管生長因子和色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等抑血管生長因子共同參與和調控CNV的發生發展［10］。臨床研究和動物實驗顯示，眼內拮抗VEGF可有效地減輕CNV的發生［11，12］。CNV的發生原因除缺氧因素外，組織學研究證實，在CNV膜上及其周圍存在著補體成分表達升高，補體系統活化的中間產物C3和VEGF的變化具有相同的趨勢［13］。因此，補體系統的活化成為CNV發生發展的另一病理生理基礎。C3a作為補體系統活化過程中最重要的補體成分之一，對CNV形成必然起到不可忽視的作用。

本研究結果提示，一定濃度C3a干預可增加RPE細胞VEGF蛋白的分泌，向有利于新生血管生長的方向變化，與相關研究報道呈現相似的趨勢［4］。從時間-效應關系分析，在相同濃度C3a刺激下，增加刺激時間可增加VEGF的蛋白分泌，其中低濃度C3a（0.1 μmol/L）需要刺激RPE細胞72 h后VEGF的升高才可達到統計學意義，而高濃度C3a（0.3 μmol/L）刺激48 h后VEGF即可顯著升高，提示以C3a為標志的補體活化程度越強，對新生血管生成因子VEGF的促進作用則越迅速；從劑量-效應關系分析，在相同刺激時間下，增加C3a濃度后，VEGF的蛋白分泌具有升高的趨勢。mRNA水平的檢測結果顯示了同樣的變化，進一步提示補體活化對RPE細胞所參與的新生血管生成的促進作用。然而，本研究結果還發現，蛋白水平的變化和mRNA水平的變化并不完全同步，0.3 μmol/L C3a作用24 h后，VEGF mRNA表達水平顯著增加，但并不伴有VEGF蛋白水平的增加，其原因可能與VEGF mRNA的轉錄后翻譯延遲，或其他細胞因子（如PEDF）和轉化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）等的相互作用有關。

此外，本研究結果發現，在無C3a作用下，RPE細胞本身可分泌一定量的VEGF（數據未顯示），這一生理現象同樣出現在既往和相關研究中［5，6］。VEGF的基礎分泌不僅對于維持脈絡膜的營養具有重要意義，同時，以VEGF為代表的促血管生成因子和PEDF等抑血管生成因子的平衡參與并維持了新生血管形成的生理性調控作用。假設在缺氧或其他損傷作用下，補體系統活化后產生包括C3a在內的活性因子，通過改變促血管生長因子和抑血管生長因子的生理平衡狀態，促進新生血管的生長，一方面啟動機體的損傷修復反應，另一方面由于新生血管尚不完善的生理功能，出現早期的滲出、出血和晚期的瘢痕形成等病理反應。因此，如何合理調控損傷修復過程，增加新生血管的正常生理功能，抑制其病理過程，對新生血管性脈絡膜視網膜病變的治療具有重要的臨床意義。

補體系統作為一個高度復雜的生物反應體系，由30余種蛋白分子所組成，它們相互作用并被體內存在的精細而復雜的機制所調控。C3a代表補體系統的活化狀態，不僅影響著VEGF等細胞因子的分泌，而且對于和CNV形成密切相關的基質金屬蛋白酶系統的功能同樣起調控作用［14］。此外，上述細胞因子和蛋白酶通過影響其上游和下游物質，如結締組織生長因子、TGF-β等，構成CNV形成的級聯效應系統。本研究初步驗證了C3a促進VEGF分泌的作用，進一步的研究將探討C3a作用下血管內皮細胞的增生、遷移等變化，從而完善補體活化狀態對新生血管管腔形成的影響，為臨床CNV的靶分子治療提供新的靶點和相應的理論依據。

［1］Lyzogubov V，Wu X，Jha P，et al.Complement regulatory protein CD46 protects against choroidal neovascularization in mice［J］.Am J Pathol，2014，184（9）：2537-2548.

［2］Rohrer B，Coughlin B，Kunchithapautham K，et al.The alternative pathway is required，but not alone sufficient，for retinal pathology in mouse laser-induced choroidal neovascularization［J］.Mol Immunol，2011，48（6-7）：e1-e8.

［3］Nita M，Grzybowski A，Ascaso FJ，et al.Age-related macular degeneration in the aspect of chronic low-grade inflammation（pathophysiological parainflammation）［J］.Mediators Inflamm，2014，2014：930671.doi：10.1155/2014/930671.

［4］Nozaki M，Raisler BJ，Sakurai E，et al.Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（7）：2328-2333.

［5］Cortright DN，Meade R，Waters SM，et al.C5a，but not C3a，increases VEGF secretion in ARPE-19 human retinal pigment epithelial cells［J］.Curr Eye Res，2009，34（1）：57-61.

［6］李瑩，張瀟，趙潺，等.白細胞介素-1β促人視網膜色素上皮細胞分泌血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的研究［J］.中華眼底病雜志，2009，25（5）：376-379.

［7］Zarbin MA，Casaroli-Marano RP，Rosenfeld PJ.Age-related macular degeneration：clinical findings，histopathology and imaging techniques［J］.Dev Ophthalmol，2014，53：1-32.

［8］Neelam K，Cheung CM，Ohno-Matsui K，et al.Choroidal neovascularization in pathological myopia［J］.Prog Retin Eye Res，2012，31（5）：495-525.

［9］Yuzawa M.Polypoidal choroidal vasculopathy［J］.Nihon Ganka Gakkai Zasshi，2012，116（3）：200-231；232.

［10］Campa C，Costagliola C，Incorvaia C，et al.Inflammatory mediators and angiogenic factors in choroidal neovascularization：pathogenetic interactions and therapeutic implications［J］.Mediators Inflamm，2010：2010.doi：10.1155/2010/546826.

［11］Freitas-Da-Costa P，Pinheiro-Costa J，Carvalho B，et al.Anti-VEGF therapy in myopic choroidal neovascularization：long-term results［J］.Ophthalmologica，2014，232（1）：57-63.

［12］Askou AL，Pournaras JA，Pihlmann M，et al.Reduction of choroidal neovascularization in mice by adeno-associated virus-delivered anti-vascular endothelial growth factor short hairpin RNA［J］.J Gene Med，2012，14（11）：632-641.

［13］Rohrer B，Long Q，Coughlin B，et al.A targeted inhibitor of the complement alternative pathway reduces RPE injury and angiogenesis in models of age-related macular degeneration［J］.Adv Exp Med Biol，2010，703：137-149.

［14］Takahashi K，Saha D，Shattino I，et al.Complement 3 is involved with ventilator-induced lung injury［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（12）：2138-2143.

（編輯 王又冬）

C3a Stimulatesthe Secretion ofVEGF in Human Retinal Pigment Epithelial Cells

YANGXue1，CAOXiao-guang2，LONGQin1

（1.Department of Ophthalmology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China；2.Department of Ophthalmology，Peking University People′s Hospital，Beijing 100730，China）

Objective To investigate the effect of C3a on vascular endothelial growth factor（VEGF）secretion in cultured human retinal pigment epithelial cells（RPECs）.MethodsRPECs were cultured in the presence of C3a at different concentrations（0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L）for 24 h，48 h and 72 h.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）and semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）were used to detect the protein and mRNA levels of VEGF.ResultsThe protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05）.A positive correlation was indicated between the protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L and the duration of this influence（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.1 μmol/L and 0.3 μmol/L at the time of 72 h was higher than that of 48 h and 24 h（P＜0.05），respectively. The protein expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 72 h（P＜0.01）.The mRNA expression of VEGF influenced by C3a at the concentration of 0.3 μmol/L was higher than that of 0.1 μmol/L at the time of 24 h（P＜0.01）.ConclusionC3a promotes the secretion of VEGF in RPECs in a concentration dependent manner，which indicates that the stronger the activation of complement is，the faster the promotion of neovascularization.

human retinal pigment epithelium cell；C3a；vascular endothelial growth factor

R774.1

A

0258-4646（2015）11-0966-05

國家自然科學基金（81070755）

陽雪（1990-），女，碩士研究生.

龍琴，E-mail：longqinbj@hotmail.com

2015-09-16

網絡出版時間：