KB-R7943對高脂飲食大鼠心肌離體缺血再灌注損傷的保護作用及機制

呂巖，吳楠，李雯娜，賈大林(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001)

KB-R7943對高脂飲食大鼠心肌離體缺血再灌注損傷的保護作用及機制

呂巖，吳楠，李雯娜，賈大林
(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001)

摘要:目的探討選擇性Na+/Ca2 +交換體反向轉運抑制劑KB-R7943對高脂飲食大鼠心肌離體缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法大鼠心臟給予完全缺血30min，之后再灌注120min。其中正常飲食喂養大鼠12只為對照組(C組)，高膽固醇飲食喂養大鼠48只。缺血后高膽固醇飲食大鼠做如下處理: 12只不干預(高膽固醇對照組，HC組); 12只給予KB-R7943(KB組); 12只給予KB-R7943和ATP敏感性鉀通道阻滯劑格列本脲(KB + G 組); 12只僅給予格列本脲(G組)。通過血流動力學指標評價心臟功能，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色測量心肌梗死范圍，電鏡下觀察心肌超微結構及TUNEL染色評價心肌細胞凋亡程度。結果高脂喂養后，大鼠血清TC、LDLC、HDL-C均升高。與HC組比較，其余各組HR均加快(P均＜0.05);與HC組再灌注5、30、120min比較，KB組左室發展壓、等容收縮期左室壓力上升的最大速率、等容舒張期左心室壓力下降的最大速率均升高(P均＜0.05)。各組再灌注30min內的各指標無統計學差異。C組心肌梗死程度明顯低于HC組，KB組梗死程度最輕(P均＜0.05)。與C組比較，HC組TUNEL陽性心肌細胞所占百分比均高(P均＜0.05)，KB組明顯低于HC、KB + G組、G 組(P均＜0.05)。HC組、KB + G組及G組心肌纖維排列紊亂，Z線扭曲，肌帶長短不一。肌細胞核形狀不規則，核心內異染色質凝聚，核膜局部模糊。KB組少數肌絲灶性溶解，線粒體腫脹輕微，少許肌漿網擴張。結論高膽固醇血癥可增加缺血心肌的損傷程度，但不影響心臟收縮功能; KB-R7943通過ATP敏感性鉀通阻滯劑減少高脂飲食大鼠缺血心肌壞死及細胞凋亡，從而減輕缺血再灌注損傷。

關鍵詞:缺血再灌注損傷;高脂血癥;細胞凋亡; Na+/Ca2 +交換體反向轉運抑制劑;大鼠

心肌缺血再灌注(I/R)后Na+/Ca2 +交換體(NCX)反向轉運的激活加重鈣超載是心肌I/R損傷的重要機制［1］，通過抑制NCX來減輕I/R時的鈣超載是減輕I/R的有效途徑。KB-R7943是一種新型的NCX反向轉運抑制劑。既往一些研究證實，KB-R7943能夠減少心肌缺血后酶的釋放［2，3］，減輕心肌梗死程度以及致命性的再灌注損傷［4～6］，模擬缺血后處理的作用。但在高脂條件下它是否還能發揮這樣的作用仍未見有研究證實。2013年1月～2014年4月，我們對此進行了相關探討。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料60只Wistar雄性大鼠，4周齡，體質量90～100 g，飲食良好，均由中國醫科大學實驗動物部提供，按照美國國立衛生研究院《實驗動物管理與使用指南》［7］標準喂養。主要試劑及儀器: HDL、LDL檢測試劑盒(邁克科技有限公司，四川)，TC酶法試劑盒(BHKD，北京)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，美國)，TUNEL反應混合液(Calbiochem，美國)，KB-R7943(TOCRIS，英國)，格列本脲(Sigma，美國)。Langendorff離體心臟灌流系統(PL3508B2，埃德儀器國際貿易公司)，BIOPACmP150生理記錄儀(Biopac公司，美國)，透射電鏡(JEM-1200EX，日本)。

1.2動物分組及I/R損傷高脂動物模型制備60 只Wistar雄性大鼠中，12只正常飼養(普通飼料喂養8周，體質量300～350 g)(C組)。另外48只給予高脂飲食(高脂飼料喂養8周，體質量350～450 g)，平均分為高膽固醇對照組(HC組)、KB-R7943 組(KB組)、KB-R7943和ATP敏感性鉀通道(KATP)阻滯劑格列本脲組(KB + G組)、格列本脲組(G組)。全部大鼠心臟給予30min完全缺血，之后再灌注120min，高脂喂養的各組大鼠分別給予后處理: HC組單純缺血后再灌注; KB組缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943; KB + G組缺血后再灌注前加入1 μmol/L KB-R7943 +0.3 μmol/L格列

本脲; G組缺血后再灌注前給予格列本脲0.3 μmol/ L再灌注。I/R高脂動物模型制備過程:經尾靜脈給予肝素200 U，腹腔注射致死量(100mg/kg)的苯巴比妥麻醉大鼠，迅速分離心臟并置于肝素化的KH液中。將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，經主動脈逆行插管，37℃恒溫、流量1.5 L/min的95% O2/5% CO2充分飽和、37℃恒溫的K-H液灌流，心臟置于37℃恒溫瓶中，剪去左心耳，左室置入注水球囊測定灌流壓力，保持其為75mmHg，球囊充水，連接壓力傳感器。20min后待左室壓力及灌流量穩定，進行下一步試驗。

1.3大鼠血脂、血流動力學指標的測定分別于喂養前及取心臟前采血，用酶法測TC，PTA-Mg2 +沉淀法測HDL-C、LDL-C。血流動力學指標包括:心率(HR)、等容收縮期左心室壓力上升的最大速率(+dp/dt)、等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(－dp/dt)、左心室發展壓(LVDP)，通過BIOPACmP150生理記錄儀進行分析。

1.4大鼠心肌梗死程度、細胞凋亡程度的觀察每組選3只大鼠，將左心室切片進行TTC染色。計算未染色部分質量占左室總質量的百分比。每組選3只大鼠心臟組織制作石蠟切片，每只隨機選取3張切片進行TUNEL染色，光鏡下分析結果。每張切片在顯微鏡下選10個區域，計算每個區域的總細胞數及TUNEL陽性細胞數。

1.5大鼠心肌超微結構觀察每組選取3只大鼠，取其心臟，左室負染色法染色后通過透射電鏡觀察心肌纖維及線粒體結構。

1.6統計學方法采用SPSS14.0統計軟件。計量資料以±s表示，高脂喂養大鼠喂養前后血脂的比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;計數資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1高脂喂養前后大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C水平比較高脂喂養前TC、HDL-C、LDL-C分別為(68.6±10.5)、(47.6±7.2)、(13.7±0.5)mg，高脂喂養后分別為(106.1±3.6)、(55.8±13.0)、(25.2±1.3)mg。高脂喂養前后比較，P均＜0.05。

2.2各組血流動力學指標比較見表1。

2.3各組心肌梗死范圍比較C組、HC組、KB組、KB + G組、G組心肌梗死范圍分別為(35.0± 5.0)%、(46.0±8.7)%、(28.6±3.3)%、(42.8± 5.1)%、(47.0±8.5)%。與C組比較，HC組心肌梗死范圍大、KB組心肌梗死范圍小;與HC組比較，KB組心肌梗死范圍小(P均＜0.05)。

表1　各組血流動力學指標比較()

表1　各組血流動力學指標比較()

注:與HC組同時間比較，*P＜0.05;與其他組同時間比較，#P＜0.05。

組別　n　HR LVDP(mmHg)+dp/dt　　－dp/dt C組33±4.3 1 284±114 1 179±134 12基線　183±23 86±6.4 2 322±233 1 416±222再灌注5min　170±14 34±5.4 1 589±103 1 178±178再灌注30min　174±19 38±5.1 1 622±208 1 222±117再灌注120min　160±18 34±3.2 1 362±198 1 238±156 KB組　12基線　175±12 83±6.6 2 472±274 1 408±190再灌注5min　176±22 45±7.9*1 946±202*1 689±312*再灌注30min　178±27 47±6.0*2 066±287*1 608±202*再灌注120min　158±22 40±3.4*1 754±203*1 556±234*KB +G組　12基線　160±18 88±7.5 2 231±262 1 400±156再灌注5min　148±16 31±8.4 1 489±301 1 176±232再灌注30min　146±12 34±5.7 1 584±211 1 298±345再灌注120min　126±17 30±4.9 1 335±158 1 278±198 G組　12基線　155±16 84±6.9 2 330±198 1 401±165再灌注5min　155±12 34±6.7 1 476±225 1 188±198再灌注30min　160±15 39±4.2 1 601±201 1 274±237再灌注120min　126±21 34±3.4 1 378±167 1 256±159 HC組　12基線　157±20#82±7.3 2 318±187 1 378±107再灌注5min　148±15#32±7.7 1 466±259 1 109±167再灌注30min　155±23#38±6.5 1 589±217 1 271±189再灌注120min　125±26#

2.4各組心肌細胞凋亡程度比較C組、HC組、KB組、KB + G組、G組TUNEL陽性心肌細胞所占百分比分別為(7.1±1.4)%、(14.8±3.0)%、(5.4±1.5)%、(13.1±1.7)%、(13.9±1.5)%，與C組比較，HC組、KB + G組、G組均高(P均＜0.05);與HC組比較，KB組低(P均＜0.05)。

2.5各組心肌超微結構比較C組心肌細胞可見心肌纖維排列不規則，部分有斷裂、缺如，Z線扭曲，肌節長短不一，肌細胞腫脹。KB + G組、G組、HC組心肌纖維排列紊亂，Z線扭曲，肌節長短不一。肌細胞核形狀不規則，核內異染色質凝聚、邊集，核膜局部模糊。相鄰肌纖維間多數線粒體嵴減少明顯或近空泡化。KB組肌細胞結構正常，肌節清楚，少數肌絲灶性溶解，心肌纖維排列較整齊，部分有斷裂、缺如，Z線、M線清晰，相鄰肌纖維間有較多的線粒體，線粒體基質密度較高。

3　討論

心肌梗死是指局部心肌急性供血不足導致心肌組織壞死，是發達國家中最主要致死性疾病。發生急性心肌缺血后盡早恢復缺血區的血液灌注是阻止心肌細胞死亡的最有效途徑，然而心肌缺血后再灌

注本身會加重缺血后心肌細胞損傷，即發生I/R損傷。引起心肌I/R損傷機制的相關研究有很多，目前比較公認的機制有氧自由基的激活、鈣超載、細胞能量代謝障礙、血管內皮細胞功能異常、細胞凋亡以及NO合成和釋放減少，如何針對這些I/R后出現的心肌損害因素做出相應的處理來減少甚至消除I/R損傷是目前研究的熱點問題，但迄今為止仍沒有能夠應用于臨床的切實有效減輕I/R損傷的方法或藥物。有報道顯示，飲食所致的高脂血癥能夠通過增加氧化應激、炎癥反應、血管阻塞、細胞凋亡及抑制NO合成來加重心肌損傷;但也有部分研究報道，高脂血癥對心肌I/R損傷有保護作用［8，9］。

目前針對高脂動物模型心肌I/R損傷的研究存在很多爭議，造成這些不同結論的原因很多，如持續缺血時間、年齡、性別、種屬不同等。本研究中HC組心肌梗死程度增加，HR減低，但各組再灌注30min內的+dp/dt、-dp/dt、LVDP無統計學差異，提示高脂血癥并不影響心肌收縮功能，這與既往的研究［10］結果相同。

心肌I/R損傷中心肌細胞鈣超載是重要的機制，而心肌細胞NCX在鈣超載的發生發展中起了至關重要作用。在I/R時，Ca2 +通過NCX反向轉運的激活進入細胞內是鈣超載的重要途徑［11］。KBR7943是一種選擇性NCX反向轉運抑制劑，能夠通過抑制Ca2 +內流減輕胞質和線粒體內鈣超載，減少心肌細胞壞死。在本研究中KB組心肌梗死范圍較HC組明顯降低，證實KB-R7943在高脂條件下有減輕心肌壞死的作用。

在I/R的信號通路中，表面受體、線粒體KATP、自由基、蛋白激酶C起著關鍵作用。正常條件下，KATP通道處于關閉失活狀態。心肌缺血時，細胞內ATP濃度下降，缺血代謝產物(ADP、乳酸、H+)積聚，KATP通道開放，導致K+外向復極電流增加，細胞膜通透性增加，心肌細胞動作電位時程縮短，電壓依賴性鈣電流及心肌收縮力減弱，減少了ATP的消耗，在心肌缺血時發揮保護作用［12，13］。KB-R7943可以減少心肌缺血后的梗死程度，而格列本脲能夠消除KB-R7943的這種保護作用，提示KATP通道在其心肌保護作用中發揮重要作用。我們前期研究［6］也證實NCX抑制劑與KATP通道開放劑合用能夠進一步縮小心肌梗死范圍，這種作用可能是進一步激活了線粒體KATP通道實現的。

總之，飲食誘導的高膽固醇血癥增加缺血心肌的損傷程度，但不影響心臟收縮功能，增加細胞凋亡是其加重心肌I/R損傷的途徑之一，選擇性NCX反向轉運抑制劑KB-R7943通過KATP通道減少高脂動物缺血心肌壞死及細胞的凋亡，從而減輕I/R損傷。本研究的不足之處在于Langendorff模型作為離體模型，脫離了體內血漿蛋白、血細胞以及激素的影響，所以這些結果應用于臨床尚需進一步的在體研究證實。

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文章編號:1002-266X(2015)37-0026-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R542.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.008