早期放射性骨髓損傷微血管滲透性變化的MRI研究

王克軍，查云飛，劉昌盛，邢棟，閆力永，龔威，胡磊，王嬌

早期放射性骨髓損傷微血管滲透性變化的MRI研究

王克軍，查云飛，劉昌盛，邢棟，閆力永，龔威，胡磊，王嬌

【摘要】目的：采用動態增強MRI（DCE-MRI）定量滲透性參數探索X線照射后大鼠股骨骨髓微血管滲透性變化。方法：36只6-8周齡SD大鼠隨機分為輻射組（n=18）和對照組（n=18），輻射組大鼠接受6.0Gy高能量X線全身照射，對照組大鼠不進行照射處理。分別在X線照射前后各時間點行股骨DCE-MRI灌注成像檢查，測量股骨興趣區微血管轉運常數（Ktrans）、反流速率常數（Kep）、血漿容積分數（Vp）和血管外細胞外容積分數（Ve）；大鼠股骨行組織病理學檢查并測定微血管密度（MVD）。結果：輻射組在輻射前后各時間點DCE-MRI灌注參數Ktrans、Kep、Vp、Ve值差異均具有統計學意義（F=59.097，P＜0.01；F=21.349，P＜0.01；F=27.059，P＜0.01；F=32.061，P＜0.01）。Ktrans值逐漸增加，在輻射后第7天達到峰值；Vp值逐漸減小；Kep值照射后第4天減小（P＜0.01），第7天較第4天增大（P＜0.01）；Ve值照射后第4天增大（P＜0.01），第7天與第4天無明顯變化（P＞0.05）。相應時間節點對照組各滲透性參數之間差異無統計學意義（P值均＞0.05）。輻射組大鼠MVD與Ktrans、Kep值呈負相關（r值分別為-0.5936、-0.8055，P值均＜0.05）、與Vp呈正相關（r=0.6451，P＜0.05）、與Ve值無相關性（r=0.1426，P＞0.05）。結論：DCE-MRI定量參數可評價早期放射性骨髓損傷的微血管滲透性變化。

【關鍵詞】輻射；骨髓；微血管密度；磁共振成像

作者單位：430060 武漢，武漢大學人民醫院放射科

電離輻射導致骨髓造血細胞數量顯著減少以及造血細胞基質成分變化，進而使骨髓造血微環境受到破壞［1，2］。動態增強MRI（dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI）可以反映對比劑在骨髓微血管的灌注、滲透和廓清等整個過程，具有對骨髓微血管結構及血管滲透性進行非侵襲性定量分析的能力［3-7］。但是

DCE-MRI尚未應用于探索早期骨髓微血管輻射損傷的病理生理機制研究中。本研究動態觀察X線照射后股骨骨髓DCE-MRI各定量滲透性參數變化，并與免疫組織化學行相關性分析，旨在探討DCE-MRI各定量滲透性參數在評價早期放射性骨髓微循環損傷中的應用價值。

材料與方法

1.動物模型制備與分組

36只6～8周齡雌性SD大鼠（武漢大學醫學院動物中心提供）適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（n=18）和輻射組（n=18），對照組與輻射組大鼠均給予標準飼料喂養。輻射組大鼠持續吸入異氟烷氣體麻醉劑并俯臥于床板上，直線加速器（23-EX Vrian）6MeV X射線單次全身照射，照射劑量為6.0Gy，劑量率3Gy/min。實驗期間對照組大鼠不施加X線照射。輻射組照射前、照射后第4天、7天分別行DCE-MRI檢查。檢查結束后立即將大鼠處死，取相應大鼠完整股骨行組織病理學檢查。對照組在相同時間節點分別行DCE-MRI及病理學檢查。

2.檢查方法

采用3.0T超導MR掃描儀（Discovery MR750 Plus，USA）行MRI檢查，小動物專用4通道線圈，內經5cm。實驗大鼠麻醉后俯臥于自制動物固定模型上，將已連在導管（PE60，Becton Dickinson and Company）上的1mL注射器針頭（25GA，Becton Dickinson and Company）置于大鼠尾靜脈內，大鼠股骨位于線圈中心，行常規斜冠狀面SE T1WI和質子密度加權成像（proton density weighted imaging，PDWI）掃描，T1WI掃描參數:TR 400ms，TE 16.7ms；PDWI掃描參數:TR 2500ms，TE 36.2ms。掃描層厚3mm，視野8mm×8mm，矩陣512×512，激勵次數為2。

DCE-MRI檢查采用2D-FSPGR序列，掃描參數: TR 6.5ms，TE 2.0ms，層厚3mm，視野8mm× 8mm，矩陣256×192，翻轉角80°，連續無間隔同層掃描100幀動態圖像，掃描持續時間為4min 20s。對比劑為歐乃影，劑量0.1mmol/kg，DCE-MRI基線掃描15個動態時相之后由同一實驗員在不少于10s時間內通過導管勻速推注對比劑。在DCE-MRI檢查之前行2D-FSPGR序列（TR 6.5ms，TE 2.0ms，層厚3mm，視野8mm×8mm，矩陣256×192，翻轉角為3°、6°、9°、12°和15°）掃描，用于T1mapping的計算，結合對比劑弛豫率進行從DCE-MRI圖像信號強度到濃度的轉換［8］。

3.圖像分析

在大鼠腹主動脈勾畫感興趣區R1，通過Omni kinetics軟件（GE Healthcare）獲得R1的時間-濃度曲線，確定動脈輸入函數［9］（arterial input function，AIF），利用藥代動力學Extended Tofts雙室模型［10，11］得到股骨干中心R2（圖1）血管滲透性的各項定量參數，即血漿空間容積分數（Vp）、對比劑從血漿空間滲漏到血管外細胞外間隙（extravascular extracellular space，EES）的體積轉運常數（Ktrans）、對比劑從EES返回到血漿空間的速率常數（Kep），并根據公式計算出血管外細胞外容積分數（Ve），Ve=Ktrans/Kep。R1取圓形，選取腹主動脈層面，置于腹主動脈中心；R2取橢圓形（大小為15～20個像素，平均值為18個像素），置于股骨干骨髓腔內，重復測量3次，取平均值作為各個參數的最終測量值。R2應盡量避開骨皮質。

4.組織病理學檢查

DCE-MRI檢查完成后將大鼠脫臼處死，切開皮膚，分離顯露出股骨，離斷兩端筋膜及周圍軟組織，完整取出股骨，用10%甲醛固定，脫鈣、脫水后石蠟包埋，股骨近端用脫鈣切片機沿冠狀面切成4μm厚薄片，行HE染色以及免疫組化染色，經CD31抗體標記微血管后，每一個標本先在低倍鏡（×100）下選取3個微血管最豐富的不相連區域，在每一個區域中計數高倍鏡（×200）下的微血管數，取其平均值為微血管密度（microvessel density，MVD）值［12］。

5.統計學處理

采用SPSS16.0統計分析軟件進行統計學分析，各組計量數據用均數±標準差（x±s）表示，MVD與DCE-MRI各定量參數的相關性采用Pearson相關分析；輻射組和對照組間滲透性參數的比較采用獨立樣本t檢驗，輻射前后不同時間節點滲透性參數的比較采用ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

輻射組在X線照射前后各時間節點大鼠股骨骨髓的DCE-MRI定量參數Ktrans、Kep、Vp、Ve值差異均有統計學意義（F=59.097，P＜0.01；F=21.349，P＜0.01；F=27.059，P＜0.01；F=32.061，P＜0.01）。照射后骨髓Ktrans值逐漸增加，在照射后第7天達到峰值；Kep值照射后4天減小（P＜0.01），第7天較第4天增大（P＜0.01）；Vp值照射后逐漸減小，照射后第7天達到最低；Ve值照射后4天增大（P＜0.01），第7天與第4天無明顯變化（P＞0.05，表1，圖2）。相應時間節點對照組大鼠骨髓各滲透性參數差異無統計學意義（P＞0.05）。

常規HE染色顯示輻射組大鼠照射后第4天骨小梁稀疏，骨髓造血細胞顯著減少，其中嗜堿性有核細胞

表1　輻射組照射前后各時間節點DCE-MRI參數比較

大量減少，骨髓基質可見大量紅細胞滲出；輻射組大鼠照射后第7天出現大量脂肪細胞，嗜堿性有核細胞明顯減少（圖3）。

輻射組大鼠照射4天后骨髓微血管減少，MVD值為2.7333±0.25820，照射7天后骨髓微血管顯著減少，MVD值為0.8333±0.3444（圖4），差異有統計學意義（P＜0.05）。

以Pearson相關分析顯示，輻射組大鼠骨髓照射后各時間節點MVD與Ktrans呈負相關（r=-0.5936， P＜0.05），與Vp呈正相關（r=0.6451，P＜0.05），與Kep呈負相關（r=-0.8055，P＜0.01），與Ve無相關性（r=0.1426，P＞0.05，圖5）。

討 論

圖1　斜冠狀面PDWI大鼠股骨ROI選取示例圖。 圖2 a）照射前后各時間節點大鼠骨髓Ktrans偽彩圖；b）照射前后各時間節點大鼠骨髓Kep偽彩圖；c）照射前后各時間節點大鼠骨髓Vp偽彩圖；d）照射前后各時間節點大鼠骨髓Ve偽彩圖。圖3 a）照射后4天大鼠股骨HE染色（×200）；b）照射后7天大鼠股骨HE染色（×200）。 圖4 a）照射后4天CD31免疫組織化學染色（×200）；b）照射后4天CD31免疫組織化學染色（×200）。

圖5　輻射組照射后各時間節點骨髓MVD與DCE-MRI各定量參數Ktrans、Kep、Vp、Ve的散點圖。a）MVD與Ktrans呈負相關；b）MVD與Kep呈負相關；c）MVD與Vp呈正相關；d）MVD與Ve無相關性。

本研究采用活體DCE-MRI定量滲透性參數研究大鼠受X線照射后早期長管狀骨髓微循環的變化，結果顯示輻射后第4天、第7天骨髓Ktrans逐漸增大，在輻射后第7天達到最大；Vp逐漸減小；Kep輻射后第4天減小，第7天較第4天增大；Ve輻射后第4天增大，第7天與第4天無明顯變化。同時大鼠骨髓照射后各時間節點MVD與Ktrans、Kep、Vp存在高度的相關性，表明DCE-MRI定量滲透性參數能夠準確、客觀地反映輻射后早期骨髓微循環灌注和血管滲透性變化，其中Ktran、Vp可以定量、無創地評價輻射后早期骨髓微血管通透性及微血管密度改變。

由藥代動力學Extended Tofts雙室模型計算得出的DCE-MRI定量參數Ktrans值主要反映血管滲透性［13，14］，受輻射后第4天、第7天骨髓Ktrans值逐漸增大，Vp值逐漸減小，與病理結果顯示輻射后骨髓微循環滲透性增大，微血管密度減少相符合，可能的病理機制是輻射早期骨髓毛細血管和靜脈竇內皮受損，骨髓微血管網破壞并伴有髓內微出血灶［2，15］。輻射組大鼠骨髓照射后各時間節點MVD與Vp呈正相關，提示Vp能反映骨髓平均微血管密度，尤其對輻射后骨髓未被破壞具有灌注功能微血管的顯示較敏感［16］。MVD 與Ktrans呈負相關，輻射早期毛細血管滲透性增加，還可出現嚴重的細胞內水腫，內皮細胞腫脹，從而導致血管閉塞。輻射后第4天骨髓Kep減小，可能由于輻射后骨髓造血細胞顯著減少，致使血管外細胞外容積分數Ve增大，滲出對比劑分散在細胞外間隙，從而導致對比劑從EES返回到血漿空間減少，但是隨著輻射損傷進展，病理結果顯示脂肪細胞大量增加，逐漸替代造血細胞占據整個骨髓組織，在第7天脂肪細胞增加與造血細胞減少達到平衡，從而出現Ve在第7天與第4天保持不變的情況，Kep與Ktrans呈現一致的變化趨勢［17，18］。

電離輻射導致骨髓造血細胞數量顯著減少以及造血細胞基質成分變化，隨著造血微循環的進一步破壞，骨髓造血功能發展成不可逆性損傷。有研究顯示輻射損傷后早期應用川弓嗪等活血化瘀中藥能促進和改善骨髓血流供應，從而有助于骨髓造血功能恢復［19］。因此，輻射后早期微循環損傷診斷對造血功能恢復至關重要。然而骨髓微血管檢查主要依靠有創病理學，且無法做到動態、重復觀察；從而限制了輻射后骨髓微循環損傷早期診斷。本研究采用無創DCE-MRI定量滲透性參數準確客觀反映輻射后早期骨髓微循環灌注和血管滲透性變化，從而能為骨髓微循環輻射損傷早期治療及療效觀察提供依據。本研究還發現輻射后Ve并沒有隨著骨髓造血細胞大量減少而逐漸增大，而是在照射后第7天與第4天保持一致，結合病理提示大量增加的骨髓脂肪細胞可能逐漸替代造血細胞占據整個骨髓。以往研究表明骨髓脂肪含量增加總是與灌注減低聯系在一起［20，21］。隨著骨髓脂肪細胞堆積將壓迫封閉的骨髓腔內竇狀隙，可能是導致MVD、血漿容積分數Vp逐漸減小的重要原因。輻射后骨髓脂肪細胞數量增加是單純占據骨髓造血微環境空間，還是積極參與輻射后骨髓微血管循環的損傷有待進一步的研究。

本研究存在以下不足:①本研究僅顯示輻射后早期（7天）骨髓微循環變化，對于DCE-MRI滲透性參數與骨髓微循環中遠期病理的相關性仍需進一步研究；②本研究實驗動物全身照射的單次劑量與臨床放療患者分次劑量存在差異，實驗動物與臨床患者的放射性骨髓損傷病理變化并不完全一致。

總之，DCE-MRI定量滲透性參數可作為評價骨髓微循環輻射損傷的生物標志物，可用于骨髓微循環輻射損傷的療效評價和預后評估。

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?中樞神經影像學?

MRI study of the changes of microvascular permeability in early radiation-induced bone marrow injury in rats

WANG Kejun，ZHA Yun-fei，LIU Chang-sheng，et al.Department of Radiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，P.R.China

【Abstract】Objective:To investigate the microvascular permeability status in bone marrow of rats femur after irradiation by X-ray via quantitative perfusion parameters of dynamic contrast-enhanced MRI（DCE-MRI）.Methods:Thirty-six SD rats at the age of 6～8weeks were randomly divided into irradiation group and normal control group（n=18per group）. The irradiation group received whole body high-energy X-ray irradiation with the dosage as 6.0Gy，while the control group did not receive irradiation.Perfusion imaging using DCE-MRI was performed at different time points before and after the irradiation.The following parameters were measured including the volume transfer constant（Ktrans），efflux rate constant （Kep），blood plasma volume fraction（Vp）and extracellular extravascular volume fraction（Ve）.Then rats were sacrificed and the bone marrow of each rat's femur was immediately removed for measuring microvessel density（MVD）by histopathologic examination.Results:The irradiation group had statistically significant differences in Ktrans，Vp，Kepand Vevalues at different time points before and after the irradiation（F=59.097，P＜0.01；F=27.059，P＜0.01；F=21.349，P＜0.01；F=32.061，P＜0.01）.The Ktransvalues gradually reached a peak on the 7th day after irradiation.The Vpvalues gradually decreased.The Kepvalues decreased on the 4th day after irradiation（P＜0.01），but increased on the 7th day as compared with the 4th day（P＜0.01）.Although the Vevalues increased on the 4th day（P＜0.01），there was no statistically significant difference in ve between the 7th day and the 4th day（P＞0.05）.The control group had no statistically significant differences in permeability parameters of DCE-MRI at different time points before and after irradiation（P＞0.05，respectively）.After irradiation，the bone marrow microvessel density（MVD）showed negative correlation with Ktrans（r= -0.5936，P＜0.05）and Kep（r= -0.8055，P＜0.05），respectively，and positive correlation with Vp（r=0.6451，P＜0.05），yet with no correlation with Ve（r=0.1426，P＞0.05）.Conclusion:Quantitative perfusion prameters of DCE-MRI can be used for evaluation of the changes of microvascular permeability in early radiation-induced bone marrow injury.

【Key words】Radiation；Bone marrow；Microvascular density；Magnetic resonance imaging

收稿日期:（2014-11-19 修回日期:2015-01-27）

基金項目：湖北省自然科學基金資助項目（2013CFB242）；湖北省衛生廳科研資助項目（JX6B68）

通訊作者：查云飛，E-mail:zhayunfei999@126.com

作者簡介：王克軍（1986-），男，湖北十堰人，碩士研究生，主要從事骨骼肌與血管系統影像診斷工作。

DOI:10.13609/j.cnki.1000-0313.2015.05.010

【中圖分類號】R818.74；R445.2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1000-0313（2015）05-0545-05