積雪草酸通過改變自噬作用促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G凋亡的實驗研究

李 歡，管福琴，陳 雨，印 敏，孫 浩，王 鳴，馮 煦，單 宇

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京中山植物園，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇南京 210014）

積雪草酸通過改變自噬作用促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G凋亡的實驗研究

李 歡，管福琴，陳 雨，印 敏，孫 浩，王 鳴，馮 煦，單 宇

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京中山植物園，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇南京 210014）

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R730.264；R916.4

摘要：目的 研究積雪草酸對T98G細(xì)胞凋亡及自噬的影響。方法 MTT法分析積雪草酸對T98G細(xì)胞增殖的影響；Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬；Western blot檢測凋亡和自噬通路相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果 積雪草酸對T98G細(xì)胞增殖有抑制作用，IC50值為46.3 μmol·L－1。Annexin-V／7-AAD雙染和West-ern blot結(jié)果顯示，積雪草酸可引起Akt表達(dá)下調(diào)、線粒體膜電位下降和Caspase-3激活，進(jìn)而誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡。同時，AA可抑制T98G細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為降低MDC熒光強(qiáng)度，抑制Beclin-1、LC3-Ⅱ、Atg表達(dá)。通過氯喹上調(diào)Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)，積雪草酸抑制自噬作用被阻斷，同時促凋亡作用也明顯降低。結(jié)論 積雪草酸可同時誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡和抑制自噬，并且抑制自噬作用能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制T98G細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：積雪草酸；T98G細(xì)胞；凋亡；自噬；機(jī)制；相互作用

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．016．html

積雪草酸（asiatic acid，AA）又名亞細(xì)亞酸，屬于五環(huán)三萜類化合物中的烏蘇烷型。1971年積雪草酸被發(fā)現(xiàn)具有治療皮膚創(chuàng)傷的作用，隨后研究表明，AA具有廣泛的藥理活性，如治療慢性潰瘍、護(hù)肝、抗抑郁、防治心腦血管疾病、抗阿爾茨海默病等［1］，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AA對結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞等具有明顯的抑制作用［2－7］。本文擬AA作用于T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，研究其抑制腦癌的作用，并探討其作用機(jī)制。

1　材料

1．1細(xì)胞株和主要試劑 T98G細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；高糖型DMEM、胎牛血清（fetal bo-vine serum，F(xiàn)BS）、青霉素和鏈霉素為Gibco／Invitro-gen產(chǎn)品；積雪草酸（AA，分子式：C30H48O5，分子質(zhì)量：488.7，白色結(jié)晶，溶于水、甲醇、DMSO）由本實驗室從灰氈毛忍冬中分離得到；氯喹（chloroquine，CQ）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecyl sulfate，SDS）購自Sigma-Aldrich；RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）和BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；所有免疫印跡抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1．2儀器 Thermo-6500 CO2培養(yǎng)箱、Thermo Nap-flow超凈工作臺（美國Thermo公司）；Centrifuge 5804 R高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；IX5倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Infinite M200型酶標(biāo)儀（美國TECAN公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；MS3 digital定時微量振蕩器（德國IKA公司）；LIBROR AEL-200電子天平（日本Shi-madzu公司）。

2　方法

2．1細(xì)胞培養(yǎng) T98G細(xì)胞用含有10%FBS、10% F10、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中，每2～3天換液傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2．2MTT測定細(xì)胞的增殖活性 將對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后按5 000個／孔接種于96孔板，每孔加100 μL，培養(yǎng)24 h；次日加入含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μL，設(shè)6個劑量組，阿霉素（ADM）1 μg·L－1為陽性對照，溶劑為空白對照。培養(yǎng)72 h后，每孔加10 μL新鮮配制的5 μg·L－1MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去上清，每孔加100 μL DMSO，微型振蕩器振蕩混

勻。酶標(biāo)儀570 nm測定光密度值（A），計算細(xì)胞存活率，并按中效方程計算IC50。實驗重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率／%＝（對照組平均A值－給藥組平均A值）／對照組平均A值×100%。

2．3Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡 取狀態(tài)良好的T98G細(xì)胞，胰酶消化后接種于2 mL圓盤培養(yǎng)板中，貼壁后加藥，根據(jù)MTT結(jié)果，設(shè)空白對照組和實驗組（含有40 μmol·L－1AA），培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，冰冷PBS洗1遍，加入Hoechst 33258染液（終濃度5 mg·L－1），染色15 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。實驗重復(fù)3次。

2．4Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá) AA處理T98G細(xì)胞48 h后，提取蛋白，12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，質(zhì)量體積比為5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉，一抗（1∶1 000）封閉過夜，二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，最后用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，暗盒中膠片曝光，顯影、定影后掃描圖像。

2．5Annexin-V／7-AAD雙標(biāo)記染色檢測凋亡 根據(jù)MTT結(jié)果，設(shè)低、中、高（20、40、80μmol·L－1）濃度實驗組，檢測不同濃度AA對T98G細(xì)胞凋亡率的影響。此外，設(shè)對照（0.1%DMSO）組、AA（60 μmol ·L－1）組、CQ（5μmol·L－1）組、AA（60 μmol· L－1）＋CQ（5 μmol·L－1）組檢測細(xì)胞自噬對T98G細(xì)胞凋亡的作用。給藥48 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入An-nexin V-FITC和7-AAD（7-Amino-Actinomycin D），室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。分布于散點圖左下象限散點代表正常細(xì)胞，右下象限的散點代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限的散點代表晚期凋亡細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

2．6MDC熒光染色檢測細(xì)胞自噬 丹酰戊二胺（MDC）能選擇性地結(jié)合到自噬囊泡膜上而被用來檢測自噬的發(fā)生。實驗設(shè)對照（0.1%DMSO）組、AA（60 μmol·L－1）組、CQ（5 μmol·L－1）組、AA （60 μmol·L－1）＋CQ（5 μmol·L－1）。收集細(xì)胞加入0.05 mmol·L－1MDC于37℃避光孵育20 min，棄培養(yǎng)液，PBS懸浮，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞自噬。實驗重復(fù)3次。

2．7Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白水平 收集細(xì)胞用RIPA試劑裂解，細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉后加入相應(yīng)抗體孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，最后用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，暗盒中膠片曝光，顯影、定影后掃描圖像。

3　結(jié)果

3．1AA對T98G細(xì)胞增殖的影響 如Fig 1所示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G經(jīng)不同濃度積雪草酸處理后，細(xì)胞生長明顯受到抑制（P＜0.01），且隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞生長抑制率逐漸增大，說明AA對T98G細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，并且具有良好的劑量依賴關(guān)系。藥物處理72 h，半數(shù)抑制濃度（IC50）為46.3 μmol·L－1。

Fig 1 Effect of asiatic acid（AA）on T98G cell proliferation（±s，n＝3）

3．2AA對T98G細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組細(xì)胞生長情況較好，貼壁較牢固，細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞核被Hoechst 33258均勻的染成藍(lán)色。AA處理細(xì)胞48 h后，鏡下清晰可見細(xì)胞變圓，脫落，Hoechst 33258染色呈亮藍(lán)色。見Fig 2。

Fig 2 Morphological change of T98G cells after AA treatment（×400）

3．3細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 藥物作用48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，AA明顯誘導(dǎo)T98G凋亡（P＜0.05，P＜0.01），且凋亡率（含早期凋亡和晚期凋亡）隨著藥物濃度增加而升高，分別達(dá)到9.3%、17.2%和48.7%。見Fig 3。

Fig 3 Effects of AA on apoptosis in T98G cells（±s，n＝3）

3．4AA對T98G細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響 不同濃度AA處理T98G細(xì)胞48h后PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7以及Akt、P-Akt的表達(dá)明顯上調(diào)，而Mcl-1、Bcl-xl的表達(dá)被下調(diào)，且均呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。見Fig 4。

Fig 4 Expression of apoptosis-related factors in T98G cells treated with AA

3．5AA對T98G細(xì)胞自噬的影響 蛋白印跡法檢測顯示，不同濃度AA作用細(xì)胞48 h后，自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）Atg16L1、Atg3的表達(dá)明顯降低（Fig 5A）。以60 μmol·L－1AA處理細(xì)胞不同時間后，Beclin-1和LC3-Ⅰ／LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量均明顯降低，且呈時間依賴性（Fig 5B）。結(jié)果提示，AA可抑制T98G細(xì)胞自噬，該作用具有時間和濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，AA和氯喹（CQ）聯(lián)合用藥后可明顯降低氯喹誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平（Fig 6），這進(jìn)一步驗證AA具有抑制T98G細(xì)胞自噬作用。

Fig 5 Expression of autophagy-related factors in T98G cells treated with AA

3．6AA抑制細(xì)胞自噬作用對細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)一步研究AA和CQ聯(lián)用后對細(xì)胞凋亡作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA單獨作用時T98G細(xì)胞凋亡率為19.3%，AA與CQ聯(lián)用后，凋亡率降至17.2%，這表明AA抑制細(xì)胞自噬作用阻斷后AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用也被部分抑制，AA抑制細(xì)胞自噬作用可以促進(jìn)AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。見Fig 7。

4　討論

已有研究表明，AA可抑制人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG和LN18的增殖，主要作用機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是否有自噬作用在AA誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡中的作用尚未見報道。細(xì)胞自噬是一種機(jī)體的保護(hù)性行為，與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，自噬作用可以為腫瘤細(xì)胞提供能量，有效緩解腫瘤細(xì)胞面臨的營養(yǎng)邪僻，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活并擴(kuò)增［8－9］。也有證據(jù)表明，化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時，可導(dǎo)致細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，產(chǎn)生耐藥性，而自噬抑制劑可以減弱這種耐藥性［10］。這些研究為我們提供了研發(fā)抗腫瘤藥物的新策略。

本研究初步表明，Akt是AA抑制T98G細(xì)胞增殖的重要靶點。Akt是原癌基因c-Akt的表達(dá)產(chǎn)物，

在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細(xì)胞生理病理活動的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用［11］。AA通過抑制Akt表達(dá)，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路，抑制Bcl-xl和Mcl-1表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，Caspase-3、7和PARP活化，促使細(xì)胞凋亡。

Fig 6 Autophagy ratios of T98G cells in different groups（±s，n＝3）

Beclin1是細(xì)胞自噬過程中最重要的正調(diào)節(jié)因子，通過與Vps34／PI3K形成復(fù)合物促進(jìn)自噬［12］，本研究證實Beclin1是啟動自噬的關(guān)鍵蛋白。AA作用T98G細(xì)胞后，Beclin1的表達(dá)明顯降低，使得Atg蛋白失活，從而阻礙自噬前體結(jié)構(gòu)（PAS）的形成；同時LC3-II-PE泛素樣蛋白系統(tǒng)的作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致自噬體的形成受阻，抑制細(xì)胞自噬。

Fig 7 Apoptotic ratios of T98G cells in different groups（±s，n＝3）

近年來大量的研究結(jié)果已開始揭示自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切聯(lián)系，自噬在腫瘤預(yù)防及治療中的重要性已初露端倪［13］。普遍認(rèn)為在不同的細(xì)胞中、不同的條件下，自噬和凋亡之間的關(guān)系也隨之不同。李彩麗等［14］發(fā)現(xiàn)自噬在As2O3誘導(dǎo)的Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡中具有重要作用，自噬促進(jìn)凋亡。曾蓉等［15］則發(fā)現(xiàn)自噬對冬凌草甲素誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，抑制自噬后，細(xì)胞凋亡率增加。在本實驗中，AA誘發(fā)T98G細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞自噬并存，為了更好解釋AA抑制自噬作用在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色，我們采用AA與CQ聯(lián)用法檢測其對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明阻斷了AA抑制細(xì)胞自噬的作用后會明顯降低其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，初步表明自噬在AA誘導(dǎo)T98G細(xì)胞

凋亡的機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。

（致謝：本文實驗于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所天然產(chǎn)物化學(xué)研究中心完成。單宇、管福琴、陳雨、印敏、孫浩、王鳴、馮煦老師對本項工作提出寶貴的建議，并進(jìn)行細(xì)致的指導(dǎo)。在此致謝！）

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Asiatic acid induces apoptosis in T98G human glioblastoma cells by changing autophagy

LI Huan，GUAN Fu-qin，CHEN Yu，YIN Min，SUN Hao，WANG Ming，F(xiàn)ENG Xu，SHAN Yu
（Institute of Botany，Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences，Nanjing Botanical Garden Mem Sun Yat-sen，The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm，Nanjing 210014，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of asiatic acid on apoptosis and autophagy in human glioblastoma T98G cells．Methods MTT colorimetry was employed to assay the cellular proliferating activity．The fluores-cence microscope and Hoechst 33258 staining were used to detect the morphological changes．The cell ap- optosis and autophagy were analyzed by flow cytometry with Annexin-V／7-AAD and MDC staining respective-ly．The expressions of associated proteins were detected by Western blot to analyze the mechanism of apoptosis and autophagy．Results MTT assay showed that the growth of T 9 8 G cells was inhibited by asiatic acid

（IC50＝46.3 μmol·L－1）．Annexin V／7-AAD stai-ning and Western blot revealed that asiatic acid in-duced apoptosis in T98G cells by reducing the expres-sion of Akt，decreasing the mitochondrial membrane potential，and increasing the expression of Caspase-3．MDC staining and Western blot showed that the per-centage of MDC-positive cells was decreased and the expressions of Beclin-1，LC3-II and Atgs were inhibi-ted by asiatic acid treatment．5 μmol·L-1chloroquine was used to up-regulate the expressions of LC3-Ⅱand Beclin-1．Asiatic acid-inhibited autophagy was blocked and the total apoptotic rate was reduced remarkably．Conclusion Asiatic acid suppresses T98G cells pro-liferation by inducing apoptosis and inhibiting cell au-tophagy，and the very role of inhibiting autophagy could promote apoptosis to a certain extent．

Key words：asiatic acid；T98G cells；apoptosis；au-tophagy；mechanism；interaction

作者簡介：李 歡（1990－），女，碩士生，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究與開發(fā)，E-mail：lihuan405＠sina．cn；單 宇（1979－），男，博士，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究與開發(fā)，通訊作者，Tel：025-84347116，E-mail：shanyu79＠126．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81402829）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（No BK20131338）；江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室開放課題（No JKLBS2013003）；江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心開放基金（No藥201201）

收稿日期：2015－05－07，修回日期：2015－07－28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1363－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．008