內(nèi)向整流鉀通道激動劑對大鼠異丙腎誘發(fā)心律失常的抑制作用

李超紅，陳依春，翟旭雯，封啟龍

（山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，山西太原 030001）

內(nèi)向整流鉀通道激動劑對大鼠異丙腎誘發(fā)心律失常的抑制作用

李超紅，陳依春，翟旭雯，封啟龍

（山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，山西太原 030001）

中國圖書分類號：R-332；R329．24；R331．38；R541.7

摘要：目的 觀察內(nèi)向整流鉀通道（IK1通道）激動劑扎考必利（zacopride，Zac）對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘發(fā)大鼠心律失常的抑制作用及其機制。方法 ①利用麻醉狀態(tài)大鼠體表心電圖觀察Zac對ISO誘發(fā)心律失常的效應(yīng)；②利用細胞內(nèi)微電極技術(shù)觀察Zac對大鼠右心室乳頭肌細胞靜息電位及ISO聯(lián)合高鈣誘發(fā)延遲后除極（DADs）和觸發(fā)活動（TA）的效應(yīng)。結(jié)果 ①ISO組大鼠出現(xiàn)頻發(fā)室性期前收縮及ST段下移；與之相比，ISO＋Zac組大鼠室性期前收縮的發(fā)生率從100%降至50%（n＝6，P＜0.05），1 h內(nèi)室性期前收縮的個數(shù)從1 574±521降至33±40（n＝6，P＜0.05）。②Zac（1 μmol·L－1）使正常大鼠右心室乳頭肌細胞靜息電位從（－74.42±1.95）mV增加至（－78.50±2.07）mV（n＝6，P＜0.05）。③Zac（1μmol·L－1）可明顯抑制ISO聯(lián)合高鈣誘發(fā)的大鼠右心室乳頭肌DADs和TA，使其發(fā)生率從93.75%降至25%（n＝16，P＜0.05），且這一作用可被1 μmol·L－1BaCl2反轉(zhuǎn)。結(jié)論 選擇性IK1通道激動劑扎考必利可明顯抑制ISO誘發(fā)的室性心律失常，其機制與它增強IK1，使膜電位負值增大和抑制延遲后除極有關(guān)。這一結(jié)果進一步支持適度增強IK1是一條可行的抗心律失常途徑。

關(guān)鍵詞：內(nèi)向整流鉀通道；扎考必利；靜息電位；延遲后除極；觸發(fā)活動；異丙腎上腺素；心律失常

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．014．html

哺乳動物心肌內(nèi)向整流鉀通道（IK1通道）參與維持和穩(wěn)定靜息電位水平和動作電位3期復(fù)極終末時相的形成［1－2］。研究表明，IK1通道在心肌興奮性和心律失常發(fā)生中起著重要作用［3－5］。心衰患者中有一半并發(fā)多種形態(tài)的心律失常，并經(jīng)常由此發(fā)生猝死［6］。很多臨床和動物實驗的研究［7－8］證明，IK1的減弱是心衰時心律失常發(fā)生的重要機制。心肌缺血和心肌梗死時發(fā)生的心律失常也與IK1的下降有關(guān)，Aimond等［9］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠慢性動物心肌梗死模型的心肌IK1減小20%。因此，有人提出，適度激活I(lǐng)K1通道是抗心律失常的一條重要途徑［5，10］。

扎考必利是Liu等［11］報道的首個IK1通道選擇性激動劑，它可適度增大（增量不超過40%）IK1，這為證實激活I(lǐng)K1通道的抗心律失常作用提供了必要的工具藥物。她們在研究中已觀察到扎考必利可通過增強大鼠IK1，抑制烏頭堿（aconitine）誘發(fā)的室性心律失常和延遲后除極（DADs），但對其它原因誘發(fā)的心律失常是否有效，目前尚未見報道。

本研究使用異丙腎上腺素建立心律失常模型，觀察了扎考必利的抗心律失常作用；利用細胞內(nèi)微電極技術(shù)，觀測扎考必利對大鼠右心室乳頭肌細胞靜息電位及異丙腎上腺素聯(lián)合高鈣灌流誘發(fā)的DADs和觸發(fā)活動（TA）的作用，探討其抗心律失常的可能機制。

1　材料與方法

1．1實驗動物 SPF級成年Sprague-Dawley（SD）大鼠（230～300 g），♂。由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2012－0004。

1．2藥品與試劑 異丙腎上腺素（isoproterenol hydrochloride），批號3A／156653，購自英國Tocris公司；扎考必利（zacopride hydrochloride），批號2A／150305，購自英國Tocris公司；HEPES、BaCl2均購自美國Sigma公司；NaCl、NaH2PO4、CaCl2、KCl、MgCl2均購自Sangon Biotech公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．3主要儀器 BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)和ME-200A微電極放大器（成都泰盟軟件有限公司）；PC-10微電極拉制儀（日本Narishige公司）。

1．4主要溶液配制

1．4．1乳頭肌灌流液 Tyrode’s液（mmol·L－1）：NaH2PO40.33，NaCl 140，KCl 5．4，MgCl21.0，glu-cose 10.0，HEPES 5.0，CaCl21.8，使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38（7.35～7.40）。

1．4．2 玻璃微電極內(nèi)液 3 mol·L－1KCl。

1．5異丙腎上腺素誘發(fā)在體大鼠心臟急性心律失常和體表心電圖記錄 隨機選取健康SD大鼠（230 ～250 g）24只，分為4組。水合氯醛（30 mg·kg－1）腹腔內(nèi)注射麻醉，BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，穩(wěn)定后尾靜脈給藥。實驗分組如下：①對照組：1 mL生理鹽水（NS）尾靜脈注射；②Zac組：扎考必利（15 μg·kg－1）溶于1 mL NS尾靜脈注射；③ISO組：ISO（1 280 μg·kg－1）溶于1 mL NS尾靜脈注射；④ISO＋Zac組：扎考必利（15 μg·kg－1）溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射，3 min后ISO（1 280 μg·kg－1）溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射。

觀察各組大鼠體表心電圖，記錄藥物干預(yù)后1 h內(nèi)室性期前收縮的發(fā)生率（即各處理組中發(fā)生室性期前收縮大鼠的例數(shù)占本組大鼠總例數(shù)的百分比）、室性期前收縮個數(shù)（VPB）、ST段下移幅度。ST段測量方法參考Yamamoto等［15］所用方法。

1．6大鼠乳頭肌細胞跨膜電位記錄

1．6．1大鼠乳頭肌急性分離 取健康SD大鼠（260～300 g），麻醉后斷頭放血，快速開胸取心臟，分離右室乳頭肌，將其固定于標本槽中的硅膠墊上，恒溫37℃Tyrode’s液恒速循環(huán)灌流（流速5 mL· min－1），并持續(xù)充灌100%氧氣。

1．6．2乳頭肌細胞靜息電位記錄 乳頭肌灌流1 h后，將雙極刺激電極平行置于乳頭肌標本兩側(cè)，充灌3 mol·L－1KCl的玻璃微電極（10～20 MΩ）緩慢插入標本，基線突然下降并保持平穩(wěn)表示已達靜息電位水平，給予1 μmol·L－1扎考必利灌流，觀察扎考必利對靜息電位的影響。

1．6．3乳頭肌細胞動作電位記錄 以1 Hz，1．5倍閾刺激，波寬1 ms的正電壓方波刺激乳頭肌誘發(fā)動作電位。給予藥物干預(yù)后，各組均以5 Hz連續(xù)20次的串刺激作為條件刺激，觀測刺激后可能出現(xiàn)的DADs和TA。實驗分組如下：①對照組：Tyrode’s液灌流；②ISO＋CaCl2組：含1 μmol·L－1ISO和3．6 mmol·L－1CaCl2的Tyrode’s液灌流；③ISO＋CaCl2＋Zac組：含1 μmol·L－1ISO、3．6 mmol·L－1CaCl2和1 μmol·L－1扎考必利的Tyrode’s液灌流；④ISO＋CaCl2＋Zac＋BaCl2組：ISO＋CaCl2＋Zac組灌流液中再加入1 μmol·L－1BaCl2。觀察不同藥物組DADs和TA的變化。

1．7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，以±s表示。多個樣本間比較使用方差分析（ANOVA），兩樣本率的比較使用χ2檢驗。

2　結(jié)果

2．1扎考必利對異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠急性心律失常的影響 據(jù)Liu等［11］報道，扎考必利15 μg· kg－1濃度對烏頭堿誘發(fā)心律失常具有最大抑制效應(yīng)，本實驗同樣應(yīng)用15 μg·kg－1扎考必利。結(jié)果表明，該濃度的扎考必利可明顯抑制ISO誘發(fā)麻醉大鼠心律失常的發(fā)生。在對照組和Zac組，均未觀察到室性心律失常的發(fā)生。ISO組中，100%大鼠發(fā)生室性心律失常（頻發(fā)室性期前收縮），1 h內(nèi)室性期前收縮（VPB）個數(shù)1 574±521，ST段下移（0.243± 0.019）mV。ISO＋Zac組中，室性期前收縮發(fā)生率降低至50%（n＝6，P＜0.05），1 h內(nèi)VPB減少至33 ±40（n＝6，P＜0.05），但ST段下移幅度與ISO組無差異（n＝6，P＞0.05）（Tab 1、Fig 1）。

Tab 1 Effects of zacopride on arrhythmia induced by ISO in anesthetized rats in vivo（n＝6）

Fig 1 Electrocardiogram tracings（recorded from II limb lead）showing inhibitory effects of zacopride on arrhythmia induced by ISO in anesthetized rats in vivo

2．2扎考必利對乳頭肌細胞靜息電位和動作電位延遲后除極的影響 為了探討扎考必利抗心律失常的細胞電生理學(xué)機制，我們利用細胞內(nèi)微電極記錄了大鼠右心室乳頭肌靜息電位和動作電位，并用ISO聯(lián)合高鈣誘發(fā)DADs和TA，以觀測扎考必利的效應(yīng)。

灌流液中加入1 μmol·L－1扎考必利3 min后，乳頭肌靜息電位由（－74.42±1.95）mV增加至（－78.50±2.07）mV（n＝6，P＜0.05）。這一結(jié)果與Liu等［11］用全細胞膜片鉗記錄的結(jié)果相一致。

1 μmol·L－1ISO聯(lián)合3.6 mmol·L－1CaCl2灌流條件下，給予5 Hz的連續(xù)20次刺激后，在大鼠乳頭肌可誘發(fā)出DADs及TA；1 μmol·L－1扎考必利可明顯減少DADs和TA發(fā)生，使其發(fā)生率從93.75%降至25%（n＝16，P＜0.05），這種對DADs 及TA的抑制作用可被IK1通道選擇性阻斷劑1 μmol·L－1BaCl2阻斷（Fig 2），或經(jīng)不含扎考必利的上述灌流液沖洗后，DADs和TA又重新出現(xiàn)。1 μmol·L－1BaCl2并不能完全阻斷大鼠心肌細胞IK1，但它可以消除1 μmol·L－1扎考必利產(chǎn)生的IK1增量［11］。

Fig 2 Zacopride significantly inhibited DADs and TA induced by ISO（1 μmol·L－1）combined with CaCl2（3．6 mmol·L－1）in right ventricular papillary muscle in rats

3　討論

本研究首次在大鼠異丙腎上腺素誘發(fā)心律失常模型上觀察到IK1通道激動劑扎考必利的抗心律失常作用，并利用細胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄觀測了扎考必利對大鼠右心室乳頭肌細胞靜息電位及異丙腎上腺素聯(lián)合高鈣誘發(fā)的DADs和TA的作用。實驗結(jié)果明確顯示了扎考必利的抗心律失常作用、增大膜電位作用和抑制DADs與TA的作用。這表明，扎考必利抗心律失常作用與其增大膜電位和抑制DADs 與TA的細胞電生理機制密切相關(guān)。

心電圖ST段是心肌缺血的敏感指標。本研究中ST段下降可能是ISO增強心肌代謝和耗氧量而出現(xiàn)的心肌缺血表現(xiàn)。扎考必利在抑制VPB的同時并不影響ST段改變，表明它不干預(yù)心肌代謝與供血，其抗心律失常作用也與此無關(guān)。

我們利用細胞內(nèi)微電極記錄證明了扎考必利增大膜電位負值的作用，這與Liu等［11］利用全細胞膜片鉗記錄的研究結(jié)果相一致。確認這一結(jié)果對分析扎考必利抗心律失常作用機制至關(guān)重要。一般認為［12］，膜電位增大，可降低心肌細胞的興奮性；增加鈉通道的可利用度，提高心肌的傳導(dǎo)性；增大心肌靜息膜電導(dǎo)，減小膜電流變化引起的膜電位波動，增加膜的電穩(wěn)定性。而扎考必利增大膜電位的機制正是由于它對IK1的激動作用產(chǎn)生的［11，13］。應(yīng)該說，適度增強IK1，使靜息電位增大，這對消除任何因素引發(fā)的異常自律活動都是有益的。

DADs和由它引起的TA，是公認的引發(fā)心律失常的細胞機制。Pogwizd等［14］指出，促進DADs的因素有3個：一是肌漿網(wǎng)自發(fā)的Ca2＋釋放，二是Na＋／Ca2＋交換活性加強，后鈣瞬變（calcium-after transient）引發(fā)較強的Na＋／Ca2＋交換電流，三是IK1被抑制，膜電導(dǎo)降低，內(nèi)向的Na＋／Ca2＋交換電流引發(fā)膜電位較強的去極化。理論上，適當(dāng)激動IK1以恢復(fù)降低的膜電導(dǎo)，將有助于消除延遲后除極。我們的研究結(jié)果證實了這一點。當(dāng)灌流液中加入1 μmol·L－1扎考必利，ISO聯(lián)合高鈣誘發(fā)的DADs與TA被明顯抑制，繼續(xù)加入低濃度（1 μmol·L－1）BaCl2以特異性阻斷扎考必利產(chǎn)生的IK1增量［11］，DADs和TA又重新出現(xiàn)，表明扎考必利抑制DADs 和TA的作用是其增強IK1的效應(yīng)。

總之，我們的研究結(jié)果證明，選擇性IK1通道激動劑扎考必利可明顯抑制異丙腎上腺素誘發(fā)的心律失常，其機制可能與它通過增強IK1使膜電位負值增大和抑制延遲后除極的效應(yīng)相關(guān)。這一結(jié)果進一步支持適度增強IK1通道是一條可行的抗心律失常途徑。

（致謝：本研究全部在山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室完成，感謝實驗室提供的設(shè)備和技術(shù)支持；感謝吳博威教授和趙錄英老師給予的技術(shù)指導(dǎo)。）

參考文獻：

［1］ Hibino H，Inanobe A，F(xiàn)urutani K，et al．Inwardly rectifying po-tassium channels：their structure，function，and physiological roles ［J］．Physiol Rev，2010，90（1）：291－366．

［2］ Anumonwo J M，Lopatin A N．Cardiac strong inward rectifier po-tassium channels［J］．J Mol Cell Cardiol，2010，48（1）：45－54．

［3］ Piao L，Li J，McLerie M，Lopatin A N．Transgenic upregulation of IK1in the mouse heart is proarrhythmic［J］．Basic Res Cardiol，2007，102（5）：416－28．

［4］ Noujaim S F，Pandit S V，Berenfeld O，et al．Up-regulation of the inward rectifier K＋current（IK1）in the mouse heart acceler-ates and stabilizes rotors［J］．J Physiol，2007，578（1）：315－26．

［5］ 何海燕，尹永強，李宏杰，等．牛磺酸鎂對缺氧／復(fù)氧致大鼠心肌細胞內(nèi)向整流鉀通道異常的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2012，28（12）：1751－6．

［5］ He H Y，Yin Y Q，Li H J，et al．Effects of taurine-magnesium coordination compound on abnormal inward rectifier potassium channel current induced by hypoxia-reoxygenation in cardiomyo-cytes of rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28（12）：1751－6．

［6］ Shah M，Akar F G，Tomaselli G F．Molecular basis of arrhythmias ［J］．Circulation，2005，112（16）：2517－29．

［7］ Janse M J．Electrophysiological changes in heart failure and their relationship to arrhythmogenesis［J］．Cardiovasc Res，2004，61 （2）：208－17．

［8］ Fauconnier J，Lacampagne A，Rauzier J M，et al．Ca2＋-depend-ent reduction of IK1in rat ventricular cells：a novel paradigm for arrhythmia in heart failure［J］？Cardiovasc Res，2005，68（2）：204－12．

［9］ Aimond F，Alvarez J L，Rauzier J M，et al．Ionic basis of ventric-ular arrhythmias in remodeled rat heart during long-term myocardi-al infarction［J］．Cardiovasc Res，1999，42（2）：402－15．

［10］吳博威，劉清華，張 莉．心肌內(nèi)向整流鉀通道和心律失常［J］．生理學(xué)報，2012，64（6）：751－7．

［10］Wu B W，Liu Q H，Zhang L．Cardiac inward rectifying potassium channel and arrhythmias［J］．Acta Physiol Sin，2012，64（6）：751－7．

［11］Liu Q H，Li X L，Xu Y W，et al．A novel discovery of IK1channel agonist：zacopride selectively enhances IK1current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］．J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37－48．

［12］Gómez R，Caballero R，Barana A，et al．Nitric oxide increases cardiac IK1by nitrosylation of cysteine 76 of Kir2．1 channels［J］．Circ Res，2009，105（4）：383－92．

［13］Zhang L，Liu Q H，Liu C F，et al．Zacopride selectively activates the Kir2．1 channel via a PKA signaling pathway in rat cardiomyo-cytes［J］．Sci China Life Sci，2013，56（9）：788－96．

［14］Pogwizd S M，Schlotthauer K，Li L，et al．Arrhythmogenesis and contractile dysfunction in heart failure．Roles of sodium-calcium exchange，inward rectifier potassium current，and residual beta-adrenergic responsiveness［J］．Circ Res，2001，88（11）：1159－67．

［15］Yamamoto S，Matsui K，Sasabe M，et al．Effect of SMP-300，a new Na＋／H＋exchange inhibitor，on myocardial ischemia and ex-perimental angina models in rats［J］．Jpn J Pharmacol，2000，84 （2）：196－205．

Inhibitory effect of agonist of IK1channel on arrhythmia induced by isoproterenol in rats

LI Chao-hong，CHEN Yi-chun，ZHAI Xu-wen，F(xiàn)ENG Qi-long
（Dept of Physiology，Key Laboratory of Cellular Physiology of Shanxi Province and Ministry of Education，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China）

Abstract：Aim To investigate the inhibitory effects of zacopride（Zac）on arrhythmia induced by isoproterenol （ISO）and the underlying mechanisms in rats．Meth-ods ①ECGs were recorded in anesthetized rats in vi-vo to observe the effects of zacopride on arrhythmia in-duced by ISO．②Intracellular microelectrode tech-nique was used to investigate the effects of zacopride on resting membrane potential，delayed afterdepolariza-tions（DADs）and triggered activity（TA）induced by ISO combined with 3．6 mmol·L－1CaCl2in right ven-tricular papillary muscle of rats．Results ①In ISO group rats，ventricular premature beats（VPB）oc-curred frequently with ST-segment depression．Com-pared with ISO group，the incidence of VPB in ISO＋ Zac group decreased from 100%to 50%（n＝6，P＜0.05）and the total number of VPB recorded in 1 hour significantly reduced from 1 574±521 to 33±40（n＝6，P＜0.05）．②Zacopride at 1 μmol·L－1could hy-perpolarize the resting membrane potential of right ven-tricular papillary muscle in normal rat from（－74.42 ±1.95）mV to（－78.50±2.07）mV（n＝6，P＜0.05）．③Zacopride at 1 μmol·L－1significantly de-pressed the DADs and TA induced by ISO combined with 3.6 mmol·L－1CaCl2in right ventricular papilla-ry muscle．The incidence of DADs decreased from 93.75%in rats in ISO group to 25%in ISO＋Zac group（n＝16，P＜0.05），and this antiarrhythmic effect could be reversed by 1 μmol·L－1BaCl2．book=1085,ebook=54Conclusions Zacopride，a selective IK1channel ago-nist，can significantly inhibit cardiac arrthymia induced by ISO in rats，the mechanism of which is mainly at-tributed to zacopride-induced hyperpolarization of the resting membrane potential and subsequent suppression of DADs and TA via enhancing IK1．These results pro- vide further evidence that to enhance IK1moderately may be a feasible pathway for antiarrthymic therapy．

Key words：inward rectifier potassiumcurrent；zacopride；resting membrane potential；delayed after-depolarizations；triggerd activity；isoproterenol；ar-rhythmias

作者簡介：李超紅（1988－），女，碩士生，研究方向：心肌電生理，E-mail：sxycjslch＠163．com；封啟龍（1976－），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心肌電生理，通訊作者，E-mail：fengqilong＠163．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 30900492）；山西省青年科學(xué)基金資助項目（No 2009021043-1）；山西省高?！?31”領(lǐng)軍人才工程項目；山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持項目

收稿日期：2015－03－22，修回日期：2015－04－28

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1081－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．011