抑制NADPH氧化酶對腦缺血／再灌注損傷的保護作用

于 麗，童旭輝，樊宗兵，陳銀玲，李 言，董淑英

（蚌埠醫學院藥學系藥理學教研室，安徽蚌埠 233030）

抑制NADPH氧化酶對腦缺血／再灌注損傷的保護作用

于 麗，童旭輝，樊宗兵，陳銀玲，李 言，董淑英

（蚌埠醫學院藥學系藥理學教研室，安徽蚌埠 233030）

中國圖書分類號：R-332；R329．24；R743．310．22；R977.3

摘要：目的 研究抑制NADPH氧化酶對大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷的保護作用及可能機制。方法 利用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg ·kg－1，腦缺血2 h恢復血液再灌注24 h后，對大鼠進行神經行為學評分、腦梗死體積、腦組織病理形態學以及Cx36、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表達變化的檢測。結果 使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin，能明顯降低局灶性腦缺血／再灌注損傷大鼠神經行為學評分和腦梗死體積百分率，減輕腦組織病理形態學損傷，增加大鼠Cx36、PKC蛋白的表達，降低Bax 與Bcl-2的比值。在使用apocynin的基礎上加用PKC激酶抑制劑，與單用apocynin組相比，其上述保護作用則減弱。結論 抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦缺血／再灌注損傷，并且能增高Cx36、PKC的蛋白表達，降低Bax與Bcl-2的比值。

關鍵詞：腦缺血／再灌注損傷；NADPH氧化酶；apocynin；Cx36；PKC；凋亡

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．023．html

缺血性腦中風是一種發病率和死亡率都較高的腦血管病，闡明其發病機制、探索有效的防治措施一直是研究的熱點。由活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）引起的氧化應激是腦缺血／再灌注（ische-mia reperfusion，I／R）損傷發生的重要機制之一。以往多數研究采用自由基清除劑或者天然抗氧化劑來減輕氧化損傷，但并不能產生理想的效果，近來越來越多的研究者關注ROS的來源。有報道表明，在腦缺血時ROS主要由黃嘌呤氧化酶產生，恢復血流再灌注時ROS則主要是由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phos- phate，NADPH）氧化酶產生［1］。因此，NADPH氧化酶成為研究如何減輕腦I／R損傷的熱點。有報道表明，抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦I／R損傷，但具體的作用機制尚不明確［2］。

神經元是腦I／R損傷過程中最為敏感的細胞，它對I／R耐受性低。研究發現，腦I／R過程中往往伴隨著神經元縫隙連接蛋白Cx36的蛋白表達異常［3］。進一步研究發現，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位點，從而改變縫隙連接通道的耦合［4］。有報道表明，改變Cx36的蛋白表達以及神經元縫隙連接通道的耦合能夠明顯減輕腦I／R損傷［3］。但是尚未有報道表明，抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷的保護作用是否與PKC激酶和Cx36蛋白表達有關。研究表明腦I／R過程中往往伴隨著ROS生成增加，ROS的過度釋放能夠調控Bcl-2家族參與細胞凋亡［5－6］。抑制NADPH氧化酶能夠減少ROS的生成，那么，抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷的保護作用是否與調控Bcl-2家族參與凋亡有關？本文探討抑制NAD-PH氧化酶保護腦I／R損傷的可能機制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物 SPF級♂SD大鼠52只，體質量（300±20）g，安徽醫科大學實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（皖）2011－002］。

1．1．2主要試劑 Apocynin和Cx36單克隆抗體購于Sigma公司；PKC單克隆抗體購于Abcam公司；Bax、Bcl-2單克隆抗體購自BOSTER公司；TTC（2，3，5，-氯三苯基四氮唑）、β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均購于Sigma公司；其他試劑均為國產分析純級。

1．2實驗方法

1．2．1實驗分組 將52只大鼠隨機分為4組：假手術組（sham組）、I／R組、I／R＋apocynin組（I／R＋Apo組）、I／R＋apocynin＋PKC抑制劑GF109203X組（I／R＋Apo＋GF組），每組13只。

1．2．2模型制作 大鼠稱重，腹腔注射水合氯醛3 mL·kg－1麻醉，頸部正中切口，分離并結扎右側頸總動脈、頸外動脈，在頸內動脈和頸外動脈分叉約1 mm處做一小切口，將直徑0.32 mm的尼龍線插入頸總動脈，再經頸內動脈至大腦中動脈，進線約18 ～22 mm，栓塞大鼠大腦中動脈，造成局灶性腦缺血。Sham組進行上述操作，但不插入線栓阻斷大腦中動脈血流。I／R組缺血2 h后，恢復腦血流再灌注24 h；I／R＋Apo組于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg·kg－1，其余操作同I／R組。I／R＋Apo＋GF組于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg·kg－1，并于缺血15 min后尾靜脈注射PKC抑制劑（GF109203X）80 μg·kg－1，其余操作同I／R組。

1．2．3神經行為學評估 根據文獻報道的神經行為功能損傷的評分方法［7］，對缺血2 h再灌注24 h后的大鼠進行神經功能評分（每組13只）。0分：無神經功能缺失癥狀，活動正常；1分：提尾時手術對側的前肢內收，不能完全伸直；2分：行走時向手術對側旋轉；3分：行走時向手術對側傾倒，行動不便；4分：不能自己行走或處于昏迷狀態。神經行為評分≥1分為成功模型，評分采用雙盲法，由未參與實驗分組的成員完成。

1．2．4腦梗死體積測定 大鼠缺血2 h，再灌注24 h后快速斷頭取腦（每組6只），將大腦置于－20℃冰箱10 min。自額極2 mm向后連續等距切取6張冠狀腦片，間距為2 mm。2%TTC避光染色30 min （37℃），正常腦組織染為紅色，腦梗死組織染為白色。將染色好的腦片放置于4%多聚甲醛溶液中固定保存24 h，逐層拍照。拍照后用Image J軟件測量腦片相應部位面積，計算腦梗死體積百分率。計算公式：腦梗死體積百分率／%＝［對側大腦皮質的面積－（同側大腦皮質的面積－腦梗死的面積）］／對側大腦皮質的面積×100%［8］。

1．2．5HE染色法觀察腦組織病理形態學變化將腦缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠斷頭取腦（每組3只），將腦組織進行甲醛固定、石蠟包埋，冠狀位切片，片厚5 μm，HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察腦組織形態學變化，采集圖像。

1．2．6Western blot檢測蛋白表達變化 將腦缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠斷頭取腦（每組4只），夾取右側大腦腦組織，提取蛋白，進行標準蛋白定量。于100℃加熱5 min，每孔取20 μg蛋白樣品經15% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液封閉2 h，洗膜，與Cx36（1.25 mg·L－1）、PKC（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶2 000）單克隆抗體共同孵育，4℃過夜，洗滌后山羊抗兔抗體（1∶5 000）搖床上室溫孵育2 h，β-actin（1∶4 000）單克隆抗體室溫孵育2 h即可，其二抗為山羊抗鼠抗體（1∶1 000）。二抗孵育完畢后，洗膜，將膜與曝光液充分接觸。1 min后將膜放入凝膠圖像分析系統進行拍照。曝光時間調整在5～10 min之間。采用Bio Imaging sys-tem（Gene Genius）對圖像進行灰度掃描分析。

1．3統計學分析 采用SPSS 13．0軟件分析實驗結果，數據資料以±s表示，計量資料比較進行單因素ANOVA分析，統計圖采用Sigma Plot 10．0繪制。

2　結果

2．1抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷大鼠的神經行為學評分的影響 腦I／R后，除sham組大鼠無神經功能缺失癥狀，其他各組大鼠都有不同程度的神經功能障礙。與sham組相比，I／R組大鼠神經行為學評分明顯增高（P＜0.05）。與I／R組相比，I／R ＋Apo組大鼠的神經行為學評分明顯降低（P＜0.01）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠的神經行為學評分則明顯增高（P＜0.01）（Tab 1）。

Tab 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on neurobehavioral scores of rats with focal cerebral I／R injury（±s，n＝13）

Tab 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on neurobehavioral scores of rats with focal cerebral I／R injury（±s，n＝13）

**P＜0.01 vs I／R group；＃＃P＜0．01 vs I／R＋Apo group

Score Group　0　1　2　3　4　±s Sham　13　0　0　0　0　0 I／R　0　0　3　9　1　2．84±0．55 I／R＋Apo　0　8　4　1　0　1．46±0．66**I／R＋Apo＋GF　0　3　6　4　0　2．08±0．75＃＃

2．2抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷大鼠的腦梗死體積的影響 如Fig 1A結果顯示，TTC染色后，大鼠大腦腦梗死區域呈白色，非梗死區域呈紅色。梗死灶主要位于缺血側大腦皮質、基底節和海馬區域。用Image J軟件測量腦片相應部位面積，計算腦梗死體積百分率。Sham組大鼠大腦無明顯梗死，I／R組大鼠腦梗死明顯，腦梗死體積百分率最高。與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠大腦梗死體積明顯減少，腦梗死體積百分率明顯降低（P＜0.05）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠腦梗死體積百分率明顯增加（P＜0.05）（Fig 1B）。

2．3抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷大鼠腦組織病理形態學變化的影響 采用HE染色法觀察大鼠腦組織病理形態學的變化。如Fig 2所示，sham組大鼠腦組織中細胞排列整齊、均勻，細胞核圓形，細胞層次清晰；與sham組相比，I／R組大鼠腦組織中細胞的細胞核明顯固縮，細胞層次混亂；與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠腦組織中細胞的細胞核固縮有所減輕，細胞層次清晰；與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠腦組織病理形態學損傷明顯增強。

Fig 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the brain infarct volume of rats with cerebral I／R injury detected by TTC staining（±s，n＝6）

Fig 2 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the pathological morphological changes of rats with cerebral I／R injury observed by HE staining

2．4抑制NADPH氧化酶對腦I／R損傷大鼠腦組織中Cx36、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 采用Western blot檢測Cx36、PKC以及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表達變化。與sham組相比，I／R組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達明顯降低（P＜0.05），但是Bax／Bcl-2的比值明顯增高（P＜0.05）。與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達明顯增高（P＜0.05），Bax／Bcl-2的比值則明顯降低（P＜0.05）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達明顯降低（P＜0.05），但是Bax／Bcl-2的比值明顯增高（P＜0.05）（Fig 3、4）。

Fig 3 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Cx36 and PKC of rats with cerebral I／R injury detected by Western blot（±s，n＝4）

Fig 4 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Bax and Bcl-2 protein of rats with cerebral I／R injury detected by Western blot（±s，n＝4）

3　討論

NADPH氧化酶廣泛分布于大腦神經元細胞、星形膠質細胞、血管內皮細胞以及小膠質細胞，是腦缺血后，恢復血液再灌注時ROS最重要的來源。研究發現，使用NADPH氧化酶抑制劑或敲除NADPH氧化酶的基因可以明顯減輕氧化損傷［9－10］，表明NADPH氧化酶在保護腦I／R損傷方面具有重要意義。Apocynin又叫夾竹桃麻素、羅布麻寧、香莢蘭乙酮，是傳統中醫中的一種天然化合物。研究發現apocynin可以通過阻止p47 phox與NOX 2的組裝從而抑制NADPH氧化酶的活化［11］。已有報道表明，apocynin能夠減少大鼠腦梗死體積、神經功能缺陷以及細胞凋亡率，從而減輕腦I／R損傷，但具體的作用機制尚不明確［12］。

Cx36是縫隙連接蛋白家族的新成員，主要分布在腦組織以及視網膜。由Cx36組成的縫隙連接是最為常見的神經元細胞間偶聯形式，是神經元電信號傳導所必需的，而Cx36是唯一一個在神經系統中優先表達的縫隙連接蛋白，因此成為研究神經元縫隙連接功能改變的熱點［13］。PKC激酶屬于多功能絲氨酸／蘇氨酸激酶，廣泛調節各細胞的生理功能。有報道發現，PKC可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位點，從而改變縫隙連接通道的耦合［4］。研究表明神經元之間的電耦合很少是靜態的，動態變化的程度往往反映在蛋白表達水平的變化上［14］。有報道表明，在腦I／R過程中往往伴隨著Cx36蛋白表達以及神經元縫隙連接功能異常，而改變Cx36蛋白表達以及神經元縫隙連接通道的耦合能夠明顯減輕腦I／R損傷［3］。在心臟以及腎臟組織中主要表達Cx43蛋白，而Src激酶可以使Cx43蛋白磷酸化或直接與Cx43蛋白相結合［15－16］。有報道表明，NADPH氧化酶的活化可以通過Src激酶下調Cx43蛋白表達造成心肌損傷［15］。在腎病的動物模型中發現NADPH氧化酶的活化可以通過Src激酶上調Cx43蛋白表達，造成足細胞損傷［16］。但是尚未見報道表明在腦I／R過程中，NADPH氧化酶與PKC激酶和神經元縫隙連接蛋白Cx36之間的關系。

本實驗結果表明，抑制NADPH氧化酶能夠減少大鼠神經行為學評分，降低腦梗死百分率以及減輕腦組織病理形態損傷，從而減輕腦I／R損傷。為了探討其可能的作用機制，我們采用Western blot檢測Cx36、PKC蛋白表達變化。實驗結果顯示，與I／R組相比，使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin后，明顯增加大鼠Cx36、PKC的蛋白表達。在使用apo-cynin的基礎上加用PKC抑制劑GF109203X，與單用apocynin相比，Cx36、PKC的蛋白表達明顯降低。結果表明，抑制NADPH氧化酶減輕腦I／R損傷可能與增高Cx36、PKC的蛋白表達有關。

腦I／R過程中，ROS生成明顯增加，ROS的過度釋放可以調控Bcl-2家族參與細胞凋亡［5－6］。Bcl-2家族能夠調控線粒體膜通透性，在細胞的固有凋亡通路中有重要作用，被稱為線粒體途徑。腦缺血或缺氧后，線粒體膜蛋白的表達增加，促凋亡蛋白Bax從細胞質中進入線粒體，促進細胞色素C的釋放。細胞色素C可以和caspase-9前體的功能前區相互作用，導致caspase-3激活，并進一步激活下游的caspases［17］（包括caspases-2、6、8、10），誘導細胞凋亡。抑凋亡蛋白Bcl-2位于線粒體壁，能夠抑制細胞色素C的釋放［17］。目前，許多學者用Bax／Bcl-2的比值作為判定細胞凋亡是否被抑制或促進的重要標志［18］。Western blot結果顯示，使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin后，與I／R組相比，能夠降低Bax／Bcl-2的比值。在使用apocynin的基礎上使用PKC抑制劑，與I／R＋Apo相比，Bax／Bcl-2的比值則明顯增高。

綜上所述，抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦I／R損傷，并且能增高Cx36、PKC的蛋白表達，降低Bax與Bcl-2的比值。

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Protective effect of NADPH oxidase against cerebral ischemia／reperfusion injury

YU Li，TONG Xu-hui，FAN Zong-bing，CHEN Yin-ling，LI Yan，DONG Shu-ying
（Dept of Pharmacology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China）

Abstract：Aim To determine the protective effect of NADPH oxidase against focal cerebral ischemia／reper-fusion（I／R）injury in rats．Method A thread occlu-sion method was used to make a middle cerebral artery occlusion（MCAO）model．Apocynin（2.5 mg· kg－1）was injected by tail vein 15 min before ischemi-a．Then，the neurological behavior，cerebral infarction volume，pathological morphological changes and the expression of Cx36，PKC，Bax，Bcl-2 of rats were de- tected after ischemia for 2 h，followed by reperfusion for 24 h．Results Compared with cerebral I／R group，administration of apocynin significantly reduced the neurological behavior scores and the cerebral in-farction volume percentage，alleviated the pathological morphological damage，increased the protein expres-sion of Cx36 and PKC，and reduced the Bax／Bcl-2 ra-tio of rats with focal cerebral I／R injury．Compared with apocynin group，apocynin combined with PKCbook=1131,ebook=100inhibitor significantly reduced above protective effects．Conclusion Inhibition of NADPH oxidase could alle-viate cerebral I／R injury，increase the levels of Cx36，PKC proteins and reduce the Bax／Bcl-2 ratio．

Key words：cerebral ischemia／reperfusion injury；NADPH oxidase；apocynin；Cx36；PKC；apoptosis

作者簡介：于 麗（1990－），女，碩士生，研究方向：心腦血管藥理學，E-mail：strongpao＠163．com；董淑英（1974－），女，博士，教授，研究方向：心腦血管藥理學，通訊作者，E-mail：bbmcdsy＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81402930）；安徽省自然科學基金資助項目（No 1408085MH176）

收稿日期：2015－05－22，修回日期：2015－06－24

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1126－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．020