大鼠心室肌細胞膜片鉗技術研究生實驗設計

范 茁, 吳振強(華南理工大學 生物科學與工程學院,廣東 廣州 510006)

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大鼠心室肌細胞膜片鉗技術研究生實驗設計

范 茁, 吳振強
(華南理工大學 生物科學與工程學院,廣東 廣州 510006)

面向生物學科碩士研究生開設細胞電生理實驗可彌補高校細胞電生理實驗教學領域的空缺，使學生更好掌握細胞電生理理論知識。論文詳細闡述了依托于膜片鉗實驗技術、以大鼠心室肌細胞動作電位為主要研究對象的細胞電生理實驗課程的具體實驗內容，相關的實驗方法和實驗結果。記錄大鼠心室肌細胞的動作電位、三種主要成分(Na+、K+和Ca2+)離子電流的分離可以使學生更好理解動作電位產生的離子機制和三種主要成分電流的動力學特性。此外，記錄和觀察BK單通道和全細胞電流特征可以使學生在認識某種特異性離子通道電流特性的同時加深對膜片鉗實驗技術的理解和掌握。

細胞電生理； 膜片鉗； 動作電位； 全細胞電流； 單通道電流

0 引 言

高校各學科的教學強調理論和實踐相結合，理論學習和科學實驗相輔相成、互相促進從而提升教學的質量和效益。眾所周知，實驗能驗證理論的正確性，能使抽象的理論知識更鮮明、易懂，能培養學生的創新能力，在高校各學科尤其是生物學科的教學體系中占有非常重要的地位[1-2]。然而，細胞電生理實驗課，因為其技術難度高等客觀原因一直是大多數高校生物教學領域的空白。本文將以大鼠心室肌細胞為主要研究對象，闡述本學校生物學院為研究生開設的細胞電生理實驗課程的具體內容，包含課程涉及的具體的實驗材料、方法、步驟以及對結果的分析。本課程涉及到的實驗包括：大鼠心肌細胞動作電位和動作電流的觀測；形成心肌細胞動作電位的主要成分離子電流(Na+、K+、Ca2+)的觀測；轉染于HEK293細胞上大電導鈣激活鉀離子通道(BK)單通道及全細胞電流的觀測。

1 實驗的選擇依據

心肌細胞是除神經細胞、骨骼肌細胞外的另一大類重要的可興奮性細胞，心肌細胞電生理是心肌搏動、泵血等生理功能的基礎，對其研究有助于理解心肌興奮收縮偶聯、心跳等組織和機體電生理現象[3-5]。大鼠心室肌細胞動作電位時程較長，鈣離子通道含量相對豐富，動作電位有明顯的平臺期，這些特性使之有利于用來研究不同相期和離子電流成分的對應關系[6-7]。此外，選擇大鼠心室肌細胞作為細胞電生理實驗課程主要研究對象是跟本實驗室的科研方向相關的，我們有穩定可靠的樣品來源能保障實驗課的順利進行。

本課程還包含對BK通道單通道及全細胞電流的觀測，是為了讓學生學習某種特異性的離子通道的電生理特性及其動力學特征。采取單通道和全細胞兩種記錄方法可以讓學生掌握膜片鉗技術中兩種最普遍的記錄方式，為其以后從事此領域的研究打下基礎。BK是根據本實驗室現有的離子通道質粒選擇的，也可以選其他種類的離子通道。

2 實驗材料和方法

2.1 大鼠心肌細胞的急性分離

體重為250～300 g的大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，之后打開胸腔并迅速取下心臟，放入預冷的tyrode溶液中，輕輕擠壓心臟后迅速將其掛在langendorff灌流裝置上，無鈣tyrode液灌流4 min，之后用含0.05 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流消化1 min，再用含 0.2 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流15 min，心臟變軟后停止消化。將心臟取下，分離心室將其在含0.6 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型膠原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液中剪碎，37 ℃、50 r/min振蕩消化4 min。之后用250 μm網篩過濾，500 r/min離心45 s，加入適量含1 mmol/L Ca2+的tyrode液重力沉降6～8 min。棄上清，加入適量KB液于4 ℃保存[8-12]。

2.2 細胞培養及BK通道的轉染

HEK293細胞隔天傳代，放置于含5% CO2的培養箱37 ℃恒溫培養，隔天用胰酶消化并傳代于底部鋪有碎玻璃片的35 mm塑料平皿中。待玻片上的細胞密度達到80%左右，采用脂質體(Lipo 2000，GIBCO)轉染法，將克隆有BK通道的質粒pcDNA3.1-BK和綠色熒光蛋白GFP共轉染于HEK293細胞，24 h后選擇發綠色熒光的細胞用于膜片鉗實驗。

2.3 電生理記錄

膜片鉗記錄使用的是HEKA公司的EPC-10型號放大器(HEKA，德國)，實驗在室溫(≈22 ℃)進行。玻璃電極由Sutter公司的P97電極拉制儀(Sutter，美國)拉制而成，用于全細胞記錄的電極電阻為2～4 MΩ，用于單通道記錄的電極電阻為4～6 MΩ。全細胞記錄的采樣頻率為2 kHz，單通道記錄的采樣頻率為10 kHz。心室肌細胞動作電位由900 pA、5 ms的脈沖電流誘發，動作電流則反過來以測得的動作電位為刺激電壓程序。心室肌細胞三種成分離子電流(Na+、K+和Ca2+)的分離，則通過阻斷劑和不同的電壓脈沖程序實現。Na+電流通過1 uM TTX和時長為1 s的-40 mV鉗制電壓阻斷失活，K+電流通過TEA+和Cs+阻斷，Ca2+通道通過10 μmol/L nifedipine阻斷[13-15]。三種離子電流記錄的電壓脈沖程序分別為：Na+，-90～-10 mV;K+,-90～+30 mV;Ca2+,-40～+60 mV;三種離子混合電流，-90～+30 mV。

2.4 溶液和試劑

實驗中用到的所有配置細胞內外液的試劑和藥品均購自Sigma公司(Sigma Aldrich，美國)，各溶液配方如下。

Tyrode液(in mmol/L)：120 NaCl，5.4 KCl，25 HEPES，5 MgCl2，0.33 NaH2PO4，22 Glucose，10 Taurine(pH 7.2～7.4)。

KB液(in mmol/L):80 KOH,40 KCl,25 NaH2PO4,3 MgSO4, 50 L-glutanic acid,20 Taurine,1 EGTA,10 HEPES, 10 Glucose(pH 7.2～7.4)。

膜片鉗記錄細胞內外液。

Solution外(in mmol/L): 1.3 CaCl2, 0.8 MgSO4, 5.4 KCl, 0.4 KH2PO4, 136.9 NaCl, 0.3 Na2HPO4, 10 D-glucose and 4.2 NaHCO3(pH 7.2～7.4)。

Solution內(in mmol/L): 140 KCl, 5 ATP-Mg, 10 EGTA, 10 HEPES(pH 7.2)。

記錄鈣離子電流的細胞內液。

Solution內Ca2+(in mmol/L): 110 CsCl,5 ATP-Mg,10 EGTA,10 HEPES,30 TEA-Cl(pH 7.2)。

3 實驗結果

3.1 大鼠心室肌細胞動作電位和動作電流

圖1是在電流鉗模式下測得的大鼠心室肌細胞動作電位，以及在動作電位鉗下得到的對應于動作電位的動作電流。在實驗課上主要讓學生記錄細胞的靜息電位；觀察動作電位的形態，結合動作電流分析動作電位形成的原因；計算動作電位的時程。

3.2 大鼠心室肌細胞Na+、K+和Ca2+三種成分離子電流的分離

用nifedipine阻斷鈣通道，-90～-10 mV梯度變化的脈沖程序可以記錄到Na+通道的電流(圖2B)；外液中加TTX并用1 s、-40 mV的鉗制電壓阻斷失活Na+通道，-90～+30 mV的程序分離K+通道電流(圖2(c))；用鈣通道內液(見材料和方法2.4)并用TTX阻斷Na+通道，-40～+60 mV的電壓程序記錄Ca2+通道的電流(圖2(d))，用正常內外液，-90～+30 mV的電壓可以記錄到全部成分的離子通道電流(圖2(a))。通過本實驗，學生分離出和動作電位相關的三種主要成分的離子電流，通過觀察其激活速率、時程和流向加深對動作電位形成的離子機制的理解，實驗中及實驗后要讓學生注意觀察并分析三種不同成分離子電流的動力學特征。

圖1 大鼠心肌細胞動作電位和動作電流

(a) 電流鉗模式，給予大鼠心肌細胞900 pA，5 ms的電流刺激所得到的動作電位；(b) 電壓鉗模式下，以動作電位作為鉗制電壓程序得到心肌細胞的動作電流

圖2 大鼠心肌細胞不同成分的離子電流

3.3 BK通道的單通道及全細胞電流記錄

BK單通道采用cell-attach模式記錄，鉗制電位-110 mV，破膜后記錄BK全細胞電流，電壓脈沖程序-90～+50 mV[16]。圖3為轉染到HEK293細胞上的BK單通道及全細胞電流。實驗中讓學生觀察并記錄BK單通道和全細胞電流的幅度。通過本實驗可以使學生認識某種特定種類的離子通道亞型單通道及全細胞的電流特征。此外，通過單通道和全細胞記錄模式的練習，可以使學生加深對膜片鉗兩種7最基本和應用最廣泛的記錄方法的認識和理解。

4 結 語

本文詳細闡述了為研究生開設的膜片鉗實驗技術課程所涉及的具體實驗內容、方法和結果，以及實驗的選擇依據。我們選擇用大鼠心肌細胞為樣品研究動作電位和不同成分離子電流，是和本研究室的研究方向一致的，以神經電生理為研究方向的實驗室也可以選擇以神經元細胞為研究對象。除此之外，研究某種特異性離子通道的單通道和全細胞電流也可以選擇BK之外的任何一種通道。總之作為實驗教學課程，要以實驗操作方便和簡單，實驗結果清晰明了為原則。實驗課程以大鼠心肌細胞為研究對象，觀測其動作電位和與之對應的動作電流，進一步通過阻斷劑和鉗制電壓相結合的方法分離出三種主要成分的離子電流，可以使學生更好地理解動作電位產生的離子機制。在同一個細胞記錄同一種離子通道的單通道和全細胞電流，可以使學生學習某種特異性離子通道的電流特性，掌握膜片鉗兩種應用最廣的記錄模式，加深對膜片鉗技術的認識和理解。總之我們通過為生物學科研究生開設膜片鉗電生理實驗課程，希望可以彌補學科在細胞電生理實驗課程方面的不足，增強學生對細胞電生理理論知識的理解，擴展其知識面，提高其動手能力和創新能力。

(a) BK單通道電流

(b) BK全細胞電流

[1] 王琳琳，陳小鵬，韋小杰,等.實驗教學與課堂教學相結合培養學生理論聯系實際的能力[J].實驗室研究與探索，2007，26(9)：75-77.

[2] 張 微，溫光浩.重視實驗教學環節 加強實踐育人工作[J].實驗室研究與探索，2013，32(6)：148-150.

[3] 沈建新,韓太真,程和平. 心肌細胞興奮-收縮偶聯的微觀機制[J].生理科學進展, 2004,35(4): 294-298.

[4] 周 瑾.心臟興奮收縮偶聯[J]. 中國分子心臟病學雜志,2002,2(1):55-56.

[5] Hatem S N, Coulombe A, Balse E. Specificities of atrial electrophysiology: Clues toa better understanding of cardiac function and the mechanismsof arrhythmias[J]. J Mol Cell Cardiol, 2010, 48(1): 90-95.

[6] Ten Eick R E, Whalley D W, Rasmussen H H. Connections: heart disease, cellular electrophysiology, and ion channels [J]. FASEB J, 1992, 6(8):2568-2580.

[7] Ravens U, Wettwer E, Ohler A,etal.Electrophysiology of ion channels of the heart [J]. Fundam Clin Pharmacol, 1996, 10(4):321-328.

[8] Bilginoglu A, Kandilci H B, Turan B.Intracellular levels of Na(+) and TTX-sensitive Na(+) channel current in diabetic rat ventricular cardiomyocytes [J].CardiovascToxicol, 2013, 13(2):138-147.

[9] Egorova M V, Afanas’ev S A, Popov S V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart [J].Bull ExpBiol Med, 2005, 140(3):370-373.

[10] 熊壽貴,余更生. 成年大鼠心肌細胞的急性分離方法探討[J]. 重慶醫科大學學報, 2008, 33(7): 864-867.

[11] 韋麗蘭,莫書榮. 成年大鼠心肌細胞的急性分離方法[J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(11): 1969-1972.

[12] 王 騰,唐其柱,甘文云,等. 大鼠心肌細胞的分離技術和電生理鑒定[J]. 科技導報, 2009, 27(3):80-82.

[13] Hille B. Ion Channels of Excitable Membranes [M]. Third ed.Sunderland, MA: Sinauer Associates, 2001.

[14] Zhao Z, Yin Y, Wu H,etal. Arctigenin, a potential anti-arrhythmic agent, inhibits aconitine-induced arrhythmia by regulating multi-ionchannels[J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 32(5):1342-1353.

[15] Hennessey J A, Wei E Q, Pitt G S. Fibroblast growth factor homologous factors modulate cardiac calcium channels [J].Circ Res, 2013, 113(4):381-388.

[16] Molleman A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology [M]. Hoboken, NJ: Wiley, 2002.

Design of Patch Clamp Technique Course on Rat Ventricular Myocytes for Postgraduates

FANZhuo,WUZhen-qiang
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The experimental courses of cell electrophysiology for biological graduate students can fill the gaps in the field of cell electrophysiological experiments, and enable students to better grasp the theoretical knowledge of cell electrophysiology. This paper describes the detailed contents of the experimental courses relying on patch clamp technique and the related experimental methods and results. Recording action potential of rat ventricular myocytes and identifying the three major ion channel components (Na+, K+and Ca2+) allow students to better understand the mechanism of action potential and the dynamic properties of the three main types of ion channel currents. In addition, observation and recording the properties of BK single-channel and whole-cell current allows students to know the characteristics of a specific kind of ion channel and also to deepen their understanding and mastering in patch-clamping experimental technique.

cell electrophysiology; patch clamp; action potential; whole-cell current; single-channel current

2014-04-03

華南理工大學研究生重點課程建設項目(yjzk2011011)

范 茁(1979-)，女，河北定州人，博士，實驗師，研究方向：細胞電生理。Tel.：13560407718; E-mail:fanzhuo@scut.edu.cn

Q 291；G 642.3

A

1006-7167(2015)02-0206-03