Toll樣受體9在宮頸癌細胞中的表達及抗凋亡作用

陳　潁　周家德

Toll樣受體9在宮頸癌細胞中的表達及抗凋亡作用

陳潁周家德

[摘要]目的研究宮頸癌Hela細胞中Toll樣受體9(TLR9)的表達情況及TLR9對宮頸癌Hela細胞抗凋亡能力的影響，尋求宮頸癌免疫治療的新途徑。方法體外培養宮頸癌Hela細胞株，應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Hela細胞中TLR9 mRNA的表達情況；四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測不同濃度人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)對Hela細胞生長抑制情況；流式細胞術(FCM)檢測CpG-ODN預刺激對Hela細胞抗TRAIL誘導凋亡能力的影響。結果①TLR9 mRNA在Hela細胞中表達，應用CpG-ODN刺激24 h后，TLR9 mRNA的表達增加，與PBS對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。②MTT比色法檢測顯示，TRAIL蛋白可抑制Hela細胞生長，隨著TRAIL蛋白濃度增加，抑制率增加。并且計算半抑制濃度IC50(223.092±3.850) ng/mL。③流式細胞術檢測顯示，TLR9特異性激動劑CpG-ODN刺激Hela細胞后，TRAIL誘導細胞凋亡率為(15.32±2.46)%，與無CpG-ODN預刺激組[(43.49±2.04)%]相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論TLR9特異性激動劑CpG-ODN能夠增強Hela細胞抵抗TRAIL誘導的細胞凋亡能力，提示TLR9在腫瘤的惡性進程中發揮作用，為宮頸癌的免疫治療提供新的思路。

[關鍵詞]宮頸癌；Hela細胞；Toll樣受體9；細胞凋亡；CpG-ODN

作者單位： 230032合肥安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中占第2位，僅次于乳腺癌。近年來，宮頸癌的發病率呈穩步上升趨勢和年輕化趨勢。雖然目前有手術、化療和放療等多種綜合治療手段，但宮頸癌患者5年生存率并無明顯提高。因此，尋找新的預防和治療方法成為宮頸癌的迫切問題。Toll樣受體(TLRs)是近年來備受關注的一種細胞表面信號傳導跨膜受體，Toll樣受體9(TLR9)是TLRs家族重要成員。相對于正常宮頸上皮，TLR9在宮頸癌中的表達明顯增加，但具體作用還不清楚。本研究旨在通過檢測宮頸癌細胞TLR9的表達，并探索TLR9特異性結合配體CpG-ODN對Hela細胞TLR9表達及抗凋亡能力的影響，以探討TLR9信號通路對宮頸癌細胞抗凋亡能力的影響，為宮頸癌的免疫治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料來源宮頸癌Hela細胞株由中國科學院上海細胞庫提供；DMEM(高糖型)培養液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，均購自Sigma公司；Trizol reagent購自Invitrogin公司；RT試劑盒、PCR試劑盒均購自Fermentas公司；Recombinant Human TRAIL/Apo2L購自PEPROTECH公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司，其他試劑均為國產分析純；CpG-ODN(5’-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3’)由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養Hela細胞采用常規DMEM培養液加10%的胎牛血清，于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫密閉細胞培養箱中傳代培養。

1.2.2RT-PCR檢測Hela細胞中TLR9的表達取生長良好，鋪滿瓶底約80%的細胞消化傳代，以每孔105個細胞接種到6孔板，培養過夜，隨機分為實驗組和對照組，每組設6個復孔。實驗組加入CpG-ODN(終濃度5.0 μM)，對照組加入等體積PBS溶液；24 h后加入Trizol試劑提取總RNA，20 μL體系逆轉錄成cDNA。TLR9引物：上游引物5’-GTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3’，下游引物5’-AGTTGCCGTCCATGAATAGC-3’；內參照物采用β-肌動蛋白(β-actin)，上游引物5’-TCACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物5’-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3’。退火溫度TLR9為55℃，β-actin為52℃，反應循環數TLR9為40個循環，β-actin為35個循環。電泳結果：TLR9擴增產物長度為342 bp，β-actin擴增產物長度為173 bp。通過凝膠成像分析軟件測得TLR9 mRNA的表達，分析目標條帶與內參條帶吸光度值(A)之比，進行半定量分析，以TLR9/β-actin灰度值作為其mRNA相對表達量。實驗重復3次，計算均值。

1.2.3用MTT法檢測細胞增殖能力每孔104個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。在培養箱(37℃、5%CO2)中生長24 h貼壁后，更新培養液并加入TRAIL蛋白液使終濃度為10、20、50、100、200、500 ng/mL，每個濃度設6個復孔，另設對照組(同體積的PBS)；加藥后繼續在培養箱中作用24 h。每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，繼續孵育4 h，離心棄上清后，每孔加150 μL DMSO，選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(A)。6個復孔取均值，實驗重復3次。細胞生長抑制率為(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.4流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡取生長良好，鋪滿瓶底約80%的細胞消化傳代，以每孔106個細胞接種到6孔板，培養過夜，隨機分為TRAIL+CpG-ODN組，TRAIL組，PBS對照組。其中TRAIL+CpG-ODN組提前添加CpG-ODN(5.0 μM)預刺激12 h，TRAIL組均加入TRAIL溶液，終濃度為200 ng/mL，對照組加入等體積PBS溶液；每組設6個復孔，24 h后流式細胞術檢測凋亡率。棄去各組細胞培養液，PBS洗1次；用胰酶消化，加入含10%血清培養液終止消化；離心，1000 rpm×10 min，棄上清，加入1 mL預冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮；離心，1000 rpm×10 min，棄上清，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer；加入10 μL Annexin V-FITC輕輕搖勻，避光室溫反應15 min；加入300 μL Binding Buffer(總反應體積500 μL)以及5 μL PI，使用流式細胞儀(Beckman Coulter,Fullerton,USA)檢測；利用CellQuest Pro軟件分析數據。實驗重復3次，計算均值。

2結果

2.1CpG-ODN刺激后宮頸癌Hela細胞中TLR9 mRNA表達RT-PCR檢測結果顯示對照組及實驗組均有TLR9表達，其中對照組TLR9 mRNA相對灰度值為0.672±0.095，而實驗組(CpG-ODN組)TLR9 mRNA相對灰度值為0.845±0.102，明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

2.2TRAIL對Hela細胞生長的影響MTT比色法測定結果顯示，不同濃度的TRAIL對宮頸癌Hela細胞生長具有不同程度的抑制作用，隨著TRAIL濃度增加，對Hela細胞的殺傷抑制作用逐漸增加，呈劑量-效應關系。并且計算IC50(223.092±3.850) ng/mL,下面實驗均選用接近IC50濃度(200 ng/mL)作為實驗濃度。詳見表2、圖2。

2.3CpG-ODN對Hela細胞對抗TRAIL誘導凋亡能力的影響流式細胞儀分析結果顯示未加CpG-ODN預刺激的Hela細胞，TRAIL誘導的細胞凋亡率[(43.49±2.04)%]較高；TRAIL+CpG-ODN組凋亡率[(15.32±2.46)%]與TRAIL組比較明顯下降(P<0.05)。

3討論

3.1TLR9及其作用Toll樣受體屬于模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，參與微生物病原相關的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)識別，在天然免疫中發揮重要作用，調節適應性免疫反應。TLR9是該家族重要成員，定位于人染色體3p21.3上[1]。配體為細菌及病毒DNA中含非甲基化CpG基序和人工合成的寡氧核苷酸CpG基序[2]。TLR9信號通路屬于MyD88依賴性信號傳導通路，TLR9與CpG-ODN直接結合，同時募集MyD88，開始信號轉導。最終活化AP-1、NF-κB及IRF，導致內皮黏附分子、炎癥因子、干擾素及共刺激分子表達，在機體免疫、細胞凋亡、抗感染性等過程中發揮重要作用[3]。

3.2TLR9在宮頸癌Hela細胞中表達近年來，許多研究發現TLR9在多種婦科腫瘤細胞中表達，如乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、宮頸癌[6]。Lee等[7]研究發現，相對于正常宮頸上皮，TLR9在宮頸癌中的表達明顯增加。提示TLR9在宮頸癌的發生發展中發揮作用，但具體作用機制還不清楚。

本次實驗首先運用半定量RT-PCR方法檢測宮頸癌細胞Hela細胞株是否有TLR9的表達，同時使用TLR9特異激動劑CpG-ODN作用于Hela細胞后TLR9 mRNA表達情況，結果發現兩組Hela細胞均有TLR9表達，且CpG-ODN實驗較對照組增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。這與Jiang等[8]的TLR9在肺癌裸鼠模型中的研究結果相似。本研究結果一方面證實Hela細胞中有TLR9表達，另一方面說明CpG-ODN作為TLR9的特異性激動劑通過上調TLR9轉錄進而活化TLR9通路，發揮免疫效應。

3.3TRAIL蛋白誘導Hela細胞凋亡腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand, Apo2L)是TNF家族的新成員。Wajant等[9]用TRAIL刺激Hela細胞后均可誘發細胞凋亡。本次研究采用MTT法檢測發現TRAIL可抑制Hela細胞生長，并且生長抑制率隨藥物濃度增加而增加,與李民華等[10]研究結果相近。

3.4TLR9信號通路增強Hela細胞抗凋亡耐受能力本次實驗證實宮頸癌細胞Hela細胞中表達TLR9,進而研究TLR9是否可以增加Hela細胞系耐受TRAIL誘導細胞凋亡能力。結果發現，CpG-ODN實驗組凋亡率較PBS對照組降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明TLR9信號通路激活可加強Hela細胞抗凋亡耐受能力。

Ilvesaro等[11]檢測人類前列腺癌PC-3細胞系及臨床前列腺癌組織中均有TLR9表達，使用TLR9激動劑細菌DNA和CpG-ODN刺激TLR9表達陽性的前列腺癌細胞系，發現可以通過上調MMP-13增加癌細胞的侵襲力。而TLR9的配體不能增加無TLR9表達的前列腺癌細胞MDA-Pca2b的侵襲力。Di等[12]研究發現，以TLR9的特異性配體CpG-ODN刺激肺癌A549細胞系，可以使腫瘤細胞對TNF-α誘導的凋亡產生抵抗作用。因此，我們認為腫瘤細胞上的TLRs是有利于腫瘤細胞生存的。

本次實驗證實TLR9激動劑CpG-ODN可以增強Hela細胞抗凋亡能力。TLR9的特異性配體CpG-ODN所致Hela細胞的抗凋亡能力，通過活化TLR9信號傳導通路實現的，但其具體的分子機制仍待今后進一步的研究確定。相信隨著對模式識別受體TLR(Toll-like receptor)的生物學特性和功能的深入研究，TLR在機體免疫調控及在腫瘤發生發展中的作用和地位越來越明顯，將為尋找腫瘤免疫治療提供新思路。

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(2015-01-08收稿2015-02-21修回)

讀者·作者·編者

2015年《安徽醫學》審稿專家座談會在肥召開

為加強交流，集思廣益，不斷推進期刊的健康發展，《安徽醫學》編輯部于2015年4月9日在合肥召開了部分編委及審稿專家座談會。31位長期熱情支持《安徽醫學》期刊發展的編委、審稿專家參加座談。省醫學情報研究所曹迎慶副所長、情報研究室胡欣副主任及編輯部全體人員到會聽取專家意見。

會議由胡欣副主任主持，編輯部張迪同志向大家匯報了2014年編輯部的工作情況，蔡剛同志為各位專家介紹了新上線的“《安徽醫學》期刊在線編審系統”，并演示了在線投稿、編審等各項功能操作流程。之后，專家們在充分肯定《安徽醫學》近年來取得矚目成績的基礎上，圍繞期刊今后發展目標和任務積極建言獻策，并就審稿方式、如何組織和刊發高質量稿件、不斷提高期刊質量等議題提出了很好的意見和建議。

曹迎慶副所長代表編輯部感謝專家們長期以來對《安徽醫學》期刊的關心和支持，表示將根據專家們的意見和建議制定相應的工作計劃，不斷加強與專家們的溝通與交流，努力學習先進，改進不足，不斷提高期刊的學術水平和編輯質量，與大家共同努力，積極推進《安徽醫學》期刊的可持續發展。

《安徽醫學》編輯部

Anti-apoptosis effect of cervical cancer cell with toll-like receptor 9 signaling pathway

ChenYing,ZhouJiade

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression of TLR9 in Hela cell line and the influence of TLR9 signaling pathway on apoptosis resistance of cervical cancer cell line Hela, in order to find a new approach of immunotherapy for cervical cancer. MethodsCervical cancer Hela cell line was cultured in vitro. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to evaluate the expression level of TLR9 mRNA in Hela cells. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferation of Hela cells which was plused with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) protein at different concentrations. Flow cytometry(FCM) was used to measure the rate of apoptosis cell induced by TRAIL protein. Results①The TLR9 mRNA was detected in cervical cancer Hela cell line. And the expression level of TLR9 mRNA of Hela cells incubated with TLR9 agonistic CpG-ODN was significantly higher than that in normal controls(P<0.05).②The cell proliferation of Hela cell was inhibited by TRAIL protein and the half maximal inhibitory concentration of TRAIL protein was (223.092±3.850) ng/ml.③The percentage of apoptotic Hela cells treated with CpG-ODN was (15.32±2.46)%, which decreased markedly than the control group(43.49±2.04)% without the treatment of CpG-ODN(P<0.05). ConclusionTLR9 agonistic ligand CpG-ODN induces the resistance of Hela cells to TRAIL-induced apoptosis, which suggests TLR9 signaling plays an important role in tumor progression and leads to novel immunotherapy against cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer; Hela cells; Toll-like receptor 9; Cell apoptosis; CpG-ODN

通信作者：周家德，zhjiade@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.004