非小細胞肺癌患者血清細胞因子的檢測及其臨床意義**

祁松楠，忻寅強，王 琳，趙瑞柯，黃寶麗，彭群新，史進方，顧國浩，馬 青，蔣 敏△

(1.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科/江蘇省臨床免疫學研究所，江蘇蘇州 215000；2.中國科 學院蘇州納米技術與納米仿生研究所納米生物醫學研究部，江蘇蘇州 215000)

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·論 著·

非小細胞肺癌患者血清細胞因子的檢測及其臨床意義**

祁松楠1，忻寅強2，王 琳1，趙瑞柯1，黃寶麗1，彭群新1，史進方1，顧國浩1，馬 青2，蔣 敏1△

(1.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科/江蘇省臨床免疫學研究所，江蘇蘇州 215000；2.中國科 學院蘇州納米技術與納米仿生研究所納米生物醫學研究部，江蘇蘇州 215000)

目的 探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的量值變化在NSCLC發生發展過程中的作用。方法 采用蛋白芯片法檢測50例NSCLC患者及50例健康者血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF的濃度。結果 與健康對照組比較，NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF濃度明顯升高(P<0.01)，MCP-1濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義；與Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者血清IL-6濃度明顯升高(P<0.01)，血清MCP-1濃度降低(P<0.05)，血清GM-CSF濃度明顯降低(P<0.01)，差異有統計學意義，血清IL-8濃度差異無統計學意義(P>0.05)；與無淋巴結轉移的患者相比，有淋巴結轉移的患者血清IL-6濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義，血清IL-8、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無統計學意義(P>0.05)；與肺鱗癌患者相比，肺腺癌患者血清IL-8濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義，血清IL-6、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 血清IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF的改變與NSCLC的發生、發展密切相關，其血清學檢測有助于了解NSCLC患者的免疫功能狀態，對NSCLC分期、分型具參考價值。

非小細胞肺癌； 白細胞介素6； 白細胞介素8； 單核細胞趨化蛋白1； 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子； 蛋白芯片法

肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。世界衛生組織2012年全球腫瘤統計數據顯示，肺癌的發病率和病死率分別為13.0%和19.4%，居所有腫瘤之首，已成為全球性的健康威脅[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的一類，其發生發展與機體的免疫功能狀態密切相關。機體存在復雜的調節免疫功能的細胞因子工作網絡，各種細胞因子互相協調共同維持機體免疫功能穩態，而細胞因子與腫瘤的關系一直是腫瘤免疫學研究的熱點之一。多種細胞因子聯合定量檢測是判斷機體免疫功能的有效方法，具有重要的研究價值。本研究采用高靈敏度、高通量的蛋白芯片法檢測NSCLC患者和健康者血清中的細胞因子濃度，并結合NSCLC患者的臨床資料探討其在肺癌發生發展過程中的作用和意義，為NSCLC患者免疫功能評價和免疫治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年4～9月蘇州大學附屬第一醫院收治的初診NSCLC患者50例，其中男26例，女24例，平均年齡(67.4±9.6)歲。所有病例均經組織病理學檢查確診，其中鱗癌22例，腺癌28例。根據國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期標準：Ⅰ期13例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例，Ⅳ期14例。收集同期本院預防保健科健康體檢者50例，其中男26例，女24例，平均年齡(65.5±6.3)歲。NSCLC組和健康對照組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。患者與健康對照者均知情同意。

1.2 儀器與試劑 EZ-Plex Human Cytokine 4-plex細胞因子檢測芯片(蘇州偲聚生物材料有限公司)、GE Image Quant LAS 4000 mini 化學成像分析儀(美國General Electric Company)、TS-1脫色搖床(杰瑞爾電器有限公司)、QL-901X型漩渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)、LX-100手掌型離心機(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 采集肺癌患者及健康對照組清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h后以3 000 r/min離心10 min，將血清分裝后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 細胞因子檢測 血清細胞因子定量檢測采用蛋白芯片夾心法。首先制備標準品并根據需要進行稀釋，同時使用樣品稀釋液以1∶10稀釋血清樣本。取出蛋白芯片并于室溫下平衡20 min，從加樣孔往每個反應器內加入洗液 200 μL潤洗，靜置3 min；使用移液槍將洗液吸盡后加入200 μL配置好的血清樣品液或標準品，室溫、150 r/min孵育2 h，洗滌芯片后加入檢測抗體混合液200 μL，室溫、150 r/min孵育1 h；洗滌芯片，加入HRP標記鏈霉親和素溶液200 μL，室溫、150 r/min孵育0.5 h；洗滌芯片后向芯片表面滴加等比混好的發光底物液30 μL，將發光架移入化學發光成像儀中成像，所得圖像使用GenePix pro6.0軟件進行分析。以標準品信號值為橫坐標，標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線，根據樣品信號值在標準曲線上求出樣品濃度(pg/mL)。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據處理及統計學分析，計量資料不服從正態分布，以M(Q1,Q3)形式表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC和健康對照組血清各細胞因子濃度 與健康對照組比較，NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF濃度明顯升高(P<0.01)，MCP-1濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義。見表1。

表1 NSCLC組和健康對照組血清各細胞因子濃度[M(Q1,Q3)，pg/mL]

表2 NSCLC患者不同病理狀態下血清各細胞因子濃度[M(Q1,Q3),pg/mL]

2.2 NSCLC不同病理狀態下血清各細胞因子濃度的比較 依據NSCLC患者不同臨床病理參數進行分析分組，比較分析發現，與Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者血清IL-6濃度明顯升高(P<0.01)，血清MCP-1濃度降低(P<0.05)，血清GM-CSF濃度明顯降低(P<0.01)，差異有統計學意義，血清IL-8濃度的差異無統計學意義(P>0.05)；與無淋巴結轉移的患者相比，有淋巴結轉移的患者血清IL-6濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義，血清IL-8、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無統計學意義(P>0.05)；與肺鱗癌患者相比，肺腺癌患者血清IL-8濃度升高(P<0.05)，差異有統計學意義，血清IL-6、MCP-1、GM-CSF濃度的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

細胞因子是由活化的免疫細胞(T細胞、B細胞、NK細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞)，成纖維細胞等產生的一類分泌型糖蛋白，其以多種多樣的生物學活性，在體內構成功能性細胞因子網絡，彼此協作或相互制約，介導和調節機體免疫應答、炎性反應、造血功能，對維持機體正常的免疫功能狀態起著非常重要的調控作用。在異常情況下，細胞因子也會成為一系列病理過程的重要介質，參與炎性反應和腫瘤的發生[2]。血清中細胞因子含量普遍較低，傳統的ELISA方法難以達到良好的檢測效果。本研究采用高靈敏度、高通量的蛋白芯片法(可同時檢測數個或數十個指標)，其基本技術手段是基于一種新型的固體支撐材料——改性聚二甲基硅氮烷(iPDMS)，iPDMS獨特的表面化學能夠有效地固定蛋白質并保持其生物活性，在復雜環境下仍然能實現蛋白質的“絕對零”非特異性吸附，從而保證其滿足體外診斷的要求[3]。基于這些優點，本研究使用iPDMS作為載體，同時高效地檢測肺癌患者血清中多種細胞因子濃度。

IL-6和IL-8都屬于細胞因子網絡中具有多種效應的炎性介質，其產生受多種因素的調控，一方面可由機體免疫系統接受病毒、脂多糖、糖皮質激素等的刺激后產生，另一方面，當機體處于荷瘤狀態時，腫瘤細胞也可通過自分泌和旁分泌的方式產生這類細胞因子[4-5]。IL-6主要通過介導信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)通路來調節腫瘤細胞的增殖與分化，抑制腫瘤細胞凋亡，刺激腫瘤新生血管生成[6]。IL-8也具有調節腫瘤血管生成的作用，通過促進腫瘤組織血管的生成來促進腫瘤的生長、侵襲和轉移[7]。本研究顯示，NSCLC患者血清IL-6、IL-8濃度顯著高于健康對照組，IL-6隨著病理分期的增加以及淋巴結轉移的出現而升高，提示IL-6在NSCLC侵襲、轉移過程中發揮重要作用，這與陳春莉等[8]的研究結果基本一致。多項研究表明，血清IL-6和IL-8濃度升高是NSCLC預后不良的指標，血清IL-6和IL-8濃度的檢測有助于了解患者的免疫功能狀態、判斷疾病進展和評估預后[9-10]。本研究還發現肺腺癌血清IL-8濃度顯著高于肺鱗癌，而此前未見有關血清IL-8濃度在NSCLC不同組織類型中表達濃度不一的報道，王振元等[11]在應用逆轉錄PCR技術研究肺癌組織IL-8 mRNA表達時曾發現肺腺癌IL-8 mRNA表達高于其他組織學類型的肺癌，對于此現象的產生原因仍不清楚，可能與肺腺癌的一些生物學行為相關，如肺腺癌在早期即可侵犯血管和淋巴管，常在原發瘤引起癥狀前即已轉移。

MCP-1是一種具有重要生理作用的趨化因子，可由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等接受一定刺激后誘導分泌，在體內發揮介導免疫細胞遷移，調節血細胞發育、胚胎器官發育、血管生成、細胞凋亡等作用。GM-CSF是一種多功能造血因子，可以選擇性地刺激粒細胞、巨噬細胞增殖、分化和成熟。體外研究表明，將表達MCP-1的纖維母細胞和癌細胞共同接種動物時，其能抑制腫瘤的生長和轉移；而添加GM-CSF培養的單個核細胞用于治療早期和復發性NSCLC的研究也已經進入Ⅱ期臨床實驗階段，表明MCP-1和GM-CSF具有抗腫瘤活性[12-13]。本研究顯示，NSCLC患者血清MCP-1、GM-CSF濃度高于健康對照組，這些炎性因子的升高一方面反映了機體免疫系統發揮積極的抗腫瘤效應，另一方面細胞因子、趨化因子的持續存在和由其引發的級聯反應能夠誘導細胞增殖，趨化炎性細胞聚集，增加活性氧產物的產生，導致DNA氧化損傷，有DNA損傷或發生了基因突變的增殖細胞在富含炎性細胞和多種生物因子的微環境中繼續失控性增殖，修復程序混亂，最終癌變，也反映了細胞因子作用網絡的雙向性和復雜性[14]。腫瘤微環境中組成性表達的MCP-1、GM-CSF對腫瘤的發生、發展、轉移等病理過程有著重要作用，MCP-1、GM-CSF均可通過招募多種炎性細胞、加速血管生成的作用來促進腫瘤細胞的生長[15-16]。本研究顯示，MCP-1和GM-CSF濃度在腫瘤后期出現下降，推測可能是由于腫瘤細胞產生的免疫抑制因子所導致。

細胞因子濃度的改變與NSCLC的發生、發展密切相關，通過細胞因子的血清學檢測有助于及時了解患者的免疫功能狀態，評估腫瘤病變的分期和預后轉歸等，其同時也提示對于NSCLC的治療可以通過干預細胞因子通路來實現。然而目前細胞因子血清學檢測未得到足夠的重視和普及，究其原因可能是由于細胞因子在血清中含量較低，缺乏高靈敏度、高通量的檢測平臺，而蛋白芯片檢測技術的建立為血清細胞因子的檢測提供了高靈敏度、高通量、低成本的檢測平臺，具有很高的臨床應用前景。

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Detection and clinical significance of serum cytokines in patients with non-small cell lung cancer*

QISong-nan1,XINYin-qiang2,WANGLin1,ZHAORui-ke1,HUANGBao-li1,PENGQun-xin1，SHIJin-fang1,GUGuo-hao1,MAQing2,JIANGMin1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory/JiangsuProvincialResearchInstituteofClinicalImmunology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215000,China;2.ResearchDepartmentofNanoBiomedicine,SuzhouNanotechnologyandNanometerBionicResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Suzhou,Jiangsu215000,China)

Objective To investigate the role of changes of serum interleukin-6(IL-6),interleukin-8(IL-8),monocyte chemotactic protein(MCP-1) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) levels in the patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods The levels of serum IL-6,IL-8,MCP-1 and GM-CSF in cases of 50 NSCLC and 50 healthy controls were measured by adopting the protein microarray.Results Compared with the healthy control group,serum IL-6,IL-8 and GM-CSF levels were increased evidently(P<0.01),while serum MCP-1 level was increased (P<0.05) in the patients with NSCLC,the differences were statistically significant(P<0.05;compared with the patients with the stage Ⅰ+Ⅱ NSCLC,serum IL-6 level in the stage Ⅲ+Ⅳ was increased evidently(P<0.01),while serum MCP-1 levels was decreased (P<0.05),serum GM-CSF level in the patients with the stage Ⅲ+Ⅳ NSCLC was decreased evidently,the differences were statistically signifiant(P<0.01),there was no statistically significant difference in serum IL-8 level(P>0.05).The serum IL-6 level of the NSCLC patients with lymph node metastasis was significantly higher than that without lymph node metastasis (P<0.05),and there were no statistically significant differences in serum IL-8,MCP-1 and GM-CSF levels(P>0.05).The serum IL-8 level of lung adenocarcinoma patients was significantly higher than that of lung squamous cancer patients(P<0.05),and there were no statistically significant difference in serum IL-6,MCP-1 and GM-CSF levels(P>0.05).Conclusion The changes of serum IL-6,IL-8,MCP-1 and GM-CSF levels may be closely related to the occurrence and progression of NSCLC,their serological tests conduces to understand the immune function status of NSCLC patients and has the reference value in the staging and typing of NSCLC.

NSCLC； IL-6； IL-8； MCP-1； GM-CSF； protein microarray

江蘇省蘇州市科技計劃項目(SYS201329)。

祁松楠，女，初級檢驗師，碩士，主要從事肺癌早期診療方面的研究。

△通訊作者，E-mail：jiangmin_111@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.016

A

1672-9455(2015)16-2339-03

2015-01-25

2015-03-15)