血小板裂解液差異蛋白在原發免疫性血小板減少癥診斷中的臨床應用研究*

吳鵬強，湯計瑞，韓麗英(瀘州醫學院附屬醫院血液科，四川瀘州 646000)

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·論 著·

血小板裂解液差異蛋白在原發免疫性血小板減少癥診斷中的臨床應用研究*

吳鵬強，湯計瑞，韓麗英△(瀘州醫學院附屬醫院血液科，四川瀘州 646000)

目的 通過對原發免疫性血小板減少癥(ITP)患者血小板裂解液差異蛋白的研究,了解其與ITP發病的關系,為ITP的診斷建立一種簡便快速、靈敏度高、特異性好的實驗方法。方法 應用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測64例ITP患者及42例健康者血小板裂解液，獲得血小板蛋白質譜圖，篩選出差異蛋白，結合人工神經網絡(ANN)，建立ITP診斷模型。結果 質荷比(m/z)為3 549.17、7 678.09的蛋白在ITP組中高表達，質荷比為5 328.29、7 894.32的蛋白低表達。診斷模型的靈敏度93.3%，特異度82.6%。結論 基于血小板蛋白質譜建立的ANN模型可能對ITP的診斷具有一定的臨床價值。

原發免疫性血小板減少癥； 蛋白質組學； 表面增強激光解吸電離飛行時間質譜

原發免疫性血小板減少癥(ITP)是一種常見的由抗血小板膜抗體導致外周血小板破壞而引起的出血性疾病，2007年國際工作組(IWG)召集ITP專家在意大利舉行會議，強調其為免疫機制所介導。成人發病率為1/20 000～1/10 000，臨床上以皮膚、黏膜及內臟出血較多見。在ITP發病過程中血小板膜抗原性發生改變是疾病的根本所在，檢測血小板表面的抗原，尋找差異蛋白，可能更易了解疾病的本質特征。由于血小板無細胞核，與其他有核細胞及血清相比蛋白成分簡單，因此檢測血小板裂解液可以直接獲得ITP的疾病特征，避免血清中高豐度蛋白質的干擾。采用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)-蛋白質芯片技術檢測ITP患者和健康者血小板裂解液，在血小板蛋白質水平全景式比較指紋圖譜，尋找差異蛋白,作為ITP診斷的生物標志物，進一步完善ITP診斷模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月至2012年11月本院血液科收治的按IWG2009年ITP診斷標準診斷為ITP的住院患者,所有患者均為初診[1]。健康對照組均來自本院健康體檢中心。ITP組：ITP患者64例，男22例，女42例，年齡15～78歲，血小板(2～30)×109/L。健康對照組：健康體檢者42例，男20例，女22例，年齡18～65歲，血小板(100～300)×109/L，組間年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 前列環素應用液、乙腈、復方枸櫞酸鈉(ACD)液、芥子酸(SPA)、三羥甲基氨基甲烷(tris-HCl)緩沖液、3-環乙胺-l-丙磺酸3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、磷酸鹽緩沖液(×10)、高效液相色譜液(HPLC H2O)等均購自美國Sigma公司。蛋白質芯片時間質譜分析儀(PBSⅡ/C)、Au蛋白芯片由美國Ciphergen公司生產。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與制備 抽取清晨空腹靜脈血2～3 mL,置于枸櫞酸抗凝管內，立即加入前列環素應用液(Sigma-Aldrich公司，美國)2～3 μL，放平顛倒混勻，動作要輕柔。離心15 min，用移液管將上層富血小板血漿(PRP)置于新試管內，加2～3 μL前列環素應用液。混勻后，離心20 min,棄上層血漿(注意不要吸到貼壁的蛋白)，加入(ACD)液(Sigma-Aldrich公司，美國)0.5 mL，使血小板重懸。離心20 min，棄上清，加入0.1 mL去離子水。在-80與37 ℃之間反復快速凍融5次，離心20 min。獲得的上清液即為血小板裂解液,每30 μL分裝一管，每個樣本分裝3管，-80 ℃冰箱保存備用。所有操作均在低溫下進行，分裝時不能吸入下層的細胞，發生溶血的樣本應舍棄。

1.3.2 上樣及質譜檢測 將血小板裂解液置于冰盒表面融化后，取5 μL裂解液、5 μL SPA于新離心管(0.2 mL)底，將血小板裂解液與SPA混合后點樣，每個點加2 μL，晾干；待芯片表面晾干后，點加1 μL加能量吸收分子(EAM)，室溫晾干約15 min，重復點加1 μL，晾干后，每孔加入200 μL結合緩沖液，室溫振蕩洗滌3次，每次5 min，甩掉緩沖液，拍干后再加入200 μL HPLC液，洗脫2次，快速傾去，拍干。晾干后點加l μL SPA，10 min后重復一次，晾干后即可上機測量。采用PBSⅡ/C型蛋白質指紋圖譜儀對結合蛋白質的金芯片進行檢測，Ciphergen Proteinehip軟件自動采集質譜數據。

1.4 采集數據 用已知相對分子質量的標準蛋白質芯片All-in-one(peptide or protein)(塞弗吉公司，美國)將獲得的蛋白質分子量誤差校正到小于0.01，作好內標。根據P值小、均值差異大、標準差小的原則，采用Biomarker Wizard 3.1軟件篩選出差異蛋白。結合人工神經網絡，以32例ITP患者和21例健康者訓練組建立診斷模型，診斷模型采用輸入層含5個神經元，隱含層含5個神經元和輸出層含1個神經元。設定訓練組ITP患者的輸出值為1，健康者的輸出值為0，以0.5為界。學習率為0.01，訓練1 000次，建立并儲存ANN診斷模型。采用驗證組盲法檢測診斷模型，進行模擬仿真計算，得出模型的診斷效能。

2 結 果

表1 ITP組和健康對照組差異蛋白質的平均值、 標準差及P值比較

注：按質荷比的P值升序排列。

2.2 診斷模型的建立和效能評價 將訓練組(包含32例ITP患者、21例健康者)的上述4個蛋白質峰強度輸入BP神經網絡，建立ITP診斷模型。輸入層有4個神經元，隱含層有5個神經元，輸出層有1個神經元。輸出值越接近1，診斷ITP的可能性越大，以0.5為界。此模型的學習率設為0.01，學習次數為1 000次。用驗證組(包括另32例ITP和21例健康者)進行盲法測試，結果顯示，32例ITP樣本有4例誤判，21例健康者有2例誤判。該模型診斷ITP的靈敏度93.3%，特異度82.6%，陽性預測值87.5%，陰性預測值82.6%。見表2。

表2 診斷模型1效率分析(n)

2.3 差異蛋白的初步鑒定 根據獲得差異蛋白質質荷比，在SWISS Prot蛋白質數據庫中查詢相對應的蛋白質。網址為：http://web.expasy.org/tagident/，查詢結果如下：m/z 3 543的蛋白質對應為神經肽W-30，m/z 7 681對應的為血小板第4因子，m/z 5 322對應的為β-防御素，m/z 7 894對應的為促性腺釋放素前體。

3 討 論

ITP是最常見的出血性疾病之一，以皮膚黏膜、內臟出血較常見。目前，ITP的發病機制不明，大多數研究表明免疫機制在ITP的發病過程中起關鍵作用[2]。血小板自身抗體導致血小板破壞增加,也可抑制骨髓巨核細胞，使其數量減少、形態變化、成熟障礙，導致血小板更新減少，無效血小板生成[3]。有報道稱血小板自身抗體不僅破壞血小板，還可引起血小板功能障礙。

近年來，蛋白質組學的研究越來越受到重視。蛋白質組是指細胞、組織或器官的基因組所表達的全部蛋白質[4]。作為生命活動的執行者，蛋白質表達水平的高低與疾病發展、轉歸、藥物作用或毒素作用直接相關。疾病的發生引起蛋白質的改變，研究蛋白質可為獲得疾病的特征提供線索。SELDI-TOF-MS技術結合蛋白組學最早用于惡性腫瘤生物標志物篩選，廣泛應用于卵巢癌、肝癌、乳腺癌等多種疾病，對篩選和鑒定腫瘤特異性標志物提供有力工具，是研究蛋白質組學的理想平臺[5]。Craddock等[6]應用該技術發現α-防御素是精神分裂癥易感性標志物。Rolland[7]應用SELDI-TOF-MS技術檢測非霍奇金淋巴瘤不同亞型，獲得3個有意義的差異蛋白質，經免疫組化鑒定其中有兩個蛋白質分別為組蛋白H4和H2B，具有促進細胞增殖的作用，可以將套細胞淋巴瘤與小淋巴細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤區分開。Tumblin[8]對鐮狀紅細胞貧血的血漿蛋白質進行研究，質荷比為28.1×103、11.7×103為顯著差異蛋白質，經免疫測定法證實分別為載脂蛋白A1、血清淀粉樣蛋白A，因此，臨床上可以通過檢測這2個蛋白質來預測患者的急性疼痛發作期。

本實驗采用SELDI-TOF-MS技術直接對血小板裂解液進行研究，采用差異蛋白組學方法，獲得4個差異蛋白。m/z 3 543的蛋白質對應為神經肽W-30，腦垂體腺苷環化酶激活肽(PACAP)和血管活性腸通過肽負調控使巨核細胞和血小板生成受損[9-10]。m/z 7 681對應的為血小板第4因子，P?tschke等[11]認為在心肺旁路術后第6天易產生抗血小板因子4/肝素復合物IgG抗體，這些抗體是有免疫介導的藥物不良反應，肝素介導的血小板減少癥。m/z 5 322對應的為β-防御素，García等[12]采用蛋白質點陣法發現10個生物標志物，通過多變量邏輯回歸分析，其中β-防御素2和白細胞介素-4受體(IL-4R)可以作為急性缺血性腦卒中惡化的獨立的危險因素。m/z 7 894對應的為促性腺釋放素前體。Pazaitou等[13]認為促性腺釋放激素和神經肽受體在乳腺癌中表達提示預后不良。

本研究的優點在于能夠從小樣本量中同時檢測大量的蛋白質，從蛋白質的整體水平研究機體的復雜變化，是其他檢測技術不能替代的。這個診斷模型的診斷效能高，比單一的蛋白質峰更具說服力，靈敏度和特異度均比傳統的單一診斷方法較理想，為ITP的診斷提供了另一種參考。缺點主要是實驗樣本量較小，診斷模型還需要擴大樣本量進一步驗證。雖然盡量做到操作均衡，但是研究中仍然存在許多不可控因素，樣本中血小板計數較少，盡可能多的從中提取血小板單一成分的技術還有待進一步提高。對于SELDI-TOF-MS技術來說，每個質荷比對應的可能是很多相對分子質量相近的多肽，不能明確C末端、N末端的序列，無法鑒定蛋白的結構、功能和生物學特性，下一步的工作將篩選出的差異蛋白質提純，PCR基因檢測，鑒定蛋白質結構及功能研究。將診斷模型中的蛋白質純化后制備成探針或試劑盒，可以臨床推廣應用。

[1]Stasi R,Newland AC.ITP:a historical perspective[J].Br J Haematol,2011,153(4):437-450.

[2]Nugent D,Mcmillan R,Nichol JL,et al.Pathogenesis of chronic immune thrombocytopenia:increased platelet destruction and/or decreased platelet production[J].Br J Haematol,2009,146(6):585-596.

[3]Rodeghiero F.Standardization of terminology,definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children:report from an international working group[J].Blood,2009,113(11):2386-2393.

[4]He Y,Zhao YX,Zhu MQ,et al.Detection of autoantibodies against platelet glycoproteins in patients with immune thrombocytopenic purpura by flow cytometric immunobead array[J].Clin Chim Acta,2013,415(1):176-180.

[5]De BM,De SD,Meuwis MA,et al.Challenges for biomarker discovery in body fluids using SELDI-TOF-MS[J].Biomed Biotechnol,2010,2010:906082.

[6]Craddock RM,Huang JT,Jackson E,et al.Increased alpha-defensins as a blood marker for schizophrenia susceptibility[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(7):1204-1213.

[7]Rolland D.Identification of proteomic signatures of mantle cell lymphoma,small lymphocytic lymphoma,and marginal zone lymphoma biopsies by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry[J].Leuk Lymphoma,2011,52(4):648-658.

[8]Tumblin A.Apolipoprotein A-I and serum amyloid A plasma levels are biomarkers of acute painful episodes in patients with sickle cell disease[J].Haematologica,2010,95(9):1467-1472.

[9]Ono A,Naito T,Ito I,et al.Correlations between serial pro-gastrin-releasing peptide and neuron-specific enolase levels,and the radiological response to treatment and survival of patients with small-cell lung cancer[J].Lung Cancer,2012,76(3):439-444.

[10]Peeters K,Loyen S,Van Kerckhoven S,et al.Thrombopoietic effect of VPAC1 inhibition during megakaryopoiesis[J].Br J Haematol,2010,151(1):54-61.

[11]P?tschke C,Selleng S,Br?ker BM,et al.Heparin-induced thrombocytopenia:further evidence for a unique immune response[J].Blood,2012,120(20):4238-4245.

[12]García BT,Giralt D,Bustamante A,et al.Role of beta-defensin 2 and interleukin-4 receptor as stroke outcome biomarkers[J].J Neurochem,2014,129(3):463-472.

[13]Pazaitou PK,Chemonidou C,Poupi A,et al.Gonadotropin-releasing hormone neuropeptides and receptor in human breast cancer:correlation to poor prognosis parameters[J].Peptides,2013,42(4):15-24.

Study of clinical study of platelet lysate differential protein in diagnosis of primary immune thrombocytopenia*

WUPeng-qiang,TANGJi-rui,HANLi-ying△

(DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To establish a quick and simple diagnostic laboratory method with high sensitivity and good specificity for the diagnosis of primary immune thrombocytopenia ITP by studying platelet lysate differential protein in the patients with ITP for understanding its relationship with the onset of ITP.Methods The platelet lysate was detected in 64 cases of ITP and 42 cases of healthy people by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) technology for obtaining the platelet protein mass spectrum.The differential protein was screened and combined with the artificial neural network(ANN) for establishing the diagnostic model of ITP.Results The protein with the mass electron ratio(m/z) of 3 549.17 and 7 678.09 was highly expressed in the ITP group and which of m/z 5 328.29 and 7 894.32 was lowly expressed.The sensitivity and specificity of the diagnostic model were 93.3% and 82.6% respectively.Conclusion The established ANN model on the basis of platelet protein mass spectrum may have some clinical value for the diagnosis of ITP.

primary immune thrombocytopenia； proteomics； SELDI-TOF-MS

瀘州醫學院青年基金項目(12065)。

吳鵬強，男，主治醫師，碩士，主要從事血液系統疾病方面的研究。△

，E-mail:LYHLY@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.019

A

1672-9455(2015)16-2346-03

2015-03-05

2015-04-15)