線粒體tRNAleu區突變與腫瘤的發生及p53突變的關系

王賁士，喬錄新，張玉林，封曉昆，陳德喜，郭洪亮(山東省腫瘤醫院，濟南2507;2濟南大學山東醫學科學院與生命科學學院; 首都醫科大學附屬北京佑安醫院)

線粒體tRNAleu區突變與腫瘤的發生及p53突變的關系

王賁士1，2，喬錄新3，張玉林3，封曉昆1，2，陳德喜3，郭洪亮1
(1山東省腫瘤醫院，濟南250117;2濟南大學山東醫學科學院與生命科學學院; 3首都醫科大學附屬北京佑安醫院)

摘要:目的研究腫瘤患者線粒體DNA(mtDNA)中tRNAleu區序列3264位點上T→C突變與腫瘤發生及p53突變的關系。方法提取接受手術治療的28例肝癌及35例結腸癌患者的癌組織與癌旁組織總DNA，采用PCR法擴增mtDNA中的tRNAleu區以及p53基因全長并測序。結果所有癌組織中未見3264位點T→C的突變，但有16例在其他位點發現了突變;所有癌旁組織中未見3264位點T→C的突變，有3例在其他位點發生突變。在癌組織中發現17例p53基因突變;結腸癌組織p53突變9例，其中存在tRNAleu區突變6例、無tRNAleu區突變3例，P＜0.05;肝癌組織p53突變8例，其中存在tRNAlen區突變5例，無tRNAlen區突變3例，P＜0.05。結論tRNAleu區3264位點上T→C的突變暫不能認為與腫瘤的發生存在直接關系，該區域其他位點的突變可能是由于p53突變后喪失對該基因的保護而繼發產生的。

關鍵詞:結腸癌;肝癌;線粒體; p53; tRNAleu區序列;突變

tRNAleu是線粒體重要的片段之一，該區域相關位點的突變與糖尿病、糖尿病型耳聾等代謝性疾病有著明顯的聯系［1］。近來有文獻報道［2］，tRNAL-eu基因3264位點T→C的突變不僅能夠引起糖尿病患者產生母系遺傳性糖尿病，而且患者易患多發性腫瘤。但是，該位點突變與腫瘤發病的相關性國內尚無報道。因此，我們通過對腫瘤患者癌組織與癌旁組織tRNALeu序列的擴增比對，探討該區3264位點突變與腫瘤發生的關系;同時，擴增癌組織中的p53全長序列，分析其與p53突變之間的關系。

1　資料與方法

1.1臨床資料2010年7月～2011年1月山東省腫瘤醫院接受結腸癌手術治療的結腸癌患者35例。其中男20例、女15例，年齡45～64(56±2.6)歲，符合衛生部2010年頒布的《結腸癌規范化診療指南(試行)》中的診斷標準。2011年9月～2013年8月北京佑安醫院接受肝癌切除術的肝癌患者28例。其中男17例、女11例，年齡47～61(54±2.6)歲，符合衛生部2011年頒布的《原發性肝癌診療規范》中的診斷標準。患者均經過術前取組織病理活檢及術后腫瘤組織病理檢查確診為結腸癌以及肝癌，均以癌旁正常組織作為對照。該研究樣本均無特殊病例，體檢也無異常發現。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取取適量的癌組織以及癌旁組織，加入研磨器中;立即加入少量液氮，迅速研磨。基因組DNA的提取，按照DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)的說明書進行。

1.2.2tRNAleu、p53序列的擴增及序列分析設計合成tRNAleu序列擴增引物，上游引物為5'-AAGGTTCGTTTGTTCAACGA-3'，下游引物為5'-GGCCTAGGTTGAGGTTGACC-3'。PCR擴增反應體系:10×緩沖液5 μL，脫氧核苷三磷酸(Dntp) 4 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸餾水36.5 μL;反應條件: 94℃2 min，94℃20 s，50℃30 s，72℃90 s，35個循環，72℃10 min。p53基因全長擴增引物: p53 S 121為ATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT，p53 as 1302為TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG。PCR擴增反應體系: 94℃5 min，94℃20 s，55℃30 s，72℃120 s，35個循環，72℃10 min。取擴增產物5 μL，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳(120 V 10 min)，Tanon 1600R型凝膠成像儀成像分析。反應產物送北京博邁德生物技術有限公司完成純化和測序，測序引物同PCR引物。測序結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed比對進行序列來源鑒定。并逐一比對報告相關突變位點。

1.2.3統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。兩組樣本率的比較采用校準χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1線粒體DNA tRNAleu序列PCR擴增結果線粒體DNA tRNAleu序列擴增條帶清晰，陰性對照目標區無擴增條帶(插頁Ⅱ圖7)，測序結果堿基峰清晰。在比對后和人的線粒體DNA中tRNAleu序列相似度最高，確認擴增片段為DNA tRNAleu區序列。p53基因PCR擴增電泳圖(部分)及測序峰圖見插頁Ⅲ圖8。

2.2癌組織與癌旁組織tRNAleu區堿基序列突變比較患者均未發現3264位點上T→C突變。結腸癌組織tRNAleu區其他位點突變10例，癌旁組織2例，突變率比較，P＜0.05。肝癌組織tRNAleu區其他位點突變6例，癌旁組織1例，突變率比較，P＜0.05。

2.3癌組織p53有效突變位點統計癌組織中發現17例p53基因突變;結腸癌組織p53突變9例，其中tRNAleu區突變6例，無tRNAleu區突變3例，P＜0.05;肝癌組織p53突變8例，其中tRNAleu區突變5例，無tRNAleu區突變3例，P＜0.05。

3　討論

mtDNA缺乏組蛋白保護和有效的損傷修復系統，又處于線粒體的高氧化自由基環境中，容易出現功能結構和含量的改變［3～10］。tRNA盡管只占線粒體基因組的10%，但其突變所導致的疾病占所有疾病mtDNA突變的50%，可見其在人類疾病中的重要性［11］。其中，線粒體tRNAleu則通過一個尚未明確的機制與大量的人類疾病存在聯系［12］。最近的研究表明，mtDNA突變不斷積累在腫瘤的發生、發展中起重要作用［13～16］。因此，專家們懷疑腫瘤患者中線粒體功能障礙是由于mtDNA的3264位點突變誘導了與腫瘤發生有關的氧化應激，或使腫瘤細胞Caspase級聯反應紊亂［14，15］。

本研究未在肝癌、結腸癌組織線粒體DNA tRNAleu區發現3264位點上的T→C突變。因此，我們尚且認為文獻中所報道的病例是個案特例，暫不能證明3264位點上的T→C突變與結腸癌、肝癌的發病存在直接關系。與此同時，我們發現該區域還存在其他位點的突變，研究顯示該區域相關位點的突變與家族性糖尿病有關［11］。但是，根據相應患者的病例資料未發現該區突變相關的遺傳性疾病。同時，我們將癌組織與癌旁組織對比發現，癌組織的突變率明顯高于癌旁組織。根據以上兩點我們可以推測該區域的突變可能是在腫瘤發生后的繼發性突變［16］。眾所周知，腫瘤的發生與p53基因的突變有關，文獻報道p53的5、6、7、8外顯子為其高突變區且與腫瘤的發生有著密切聯系［12］。p53對腫瘤的抑制起到核心作用，在細胞凋亡、細胞周期調控DNA修復中同樣也起到中心作用［2］。同時，p53突變也對腫瘤的預后與轉移有影響，如大腸癌的肝轉移［12］。據文獻報道［2］，p53不僅能夠維持細胞核DNA的穩定，同時對線粒體DNA的穩定性也有重要作用。在線粒體中，p53蛋白參與到蛋白的轉錄及復制的調節中，并且維持基因的穩定性。p53蛋白在線粒體中能夠觸動線粒體的凋亡，p53的抑制將會使能量代謝從線粒體呼吸切換到有氧糖酵解，從而使腫瘤生長于低氧環境。最新研究表明［17］，線粒體基因的穩定性通過p53定位于線粒體，并刺激線粒體的單堿基切除修復通路來維持。在各種刺激下，P53能夠與線粒體內的DNA聚合酶γ相互作用，繼而啟動堿基切除修復，切除損傷基因和嘌呤、嘧啶位點，糾正線粒體DNA上的突變，從而使線粒體DNA維持穩定［3］。也有研究認為，p53綁定區域與線粒體16srDNA區域結合，該區域的任何變化(例如R273H)都可能使DNA的綁定結合，妨礙mtDNA的轉錄和復制［4］。當結腸癌組織中的p53基因發生突變，p53基因不能正常表達p53蛋白時，則進一步影響到p53蛋白以及其下游蛋白的對線粒體DNA的保護功能，從而使其突變率升高［13，18］。因此，我們對該標本又進一步擴增了p53的全長。結果顯示，25.7%的結腸癌患者存在p53突變，同時有28.5%的肝癌患者存在p53突變。將兩者的p53突變與tRNAleu區突變做對比，差異有統計學意義(P＜0.05)，故而我們初步推測p53突變與tRNAleu區的突變存在關系。tRNAleu區域的突變與細胞的代謝存在重要關系［5，19］，因此，研究腫瘤組織內該區域的高突變率可能對腫瘤細胞的代謝以及腫瘤患者的預后有重要意義。

綜上所述，mtDNA上tRNAleu區內3264位點上T→C的突變暫不能認為其與腫瘤發生存在直接關系。該區域在癌組織內的突變率明顯高于癌旁組織，其很可能與癌組織中的p53突變有關，具體這些突變與p53突變的相互作用機制以及對癌癥患者預后的影響還需要進一步研究。

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Relationships of mitochondrial tRNAleu mutations with tumorigenesis and p53 mutation

WANG Ben-shi1，QIAO Lu-xin，ZHANG Yu-lin，FENG Xiao-kun，CHEN De-xi，GUO Hong-liang
(1 Tumor Hospital of Shandong Province，Jinan 250117，China)

Abstract:Objective To investigate the relationships of T→C mutation of 3264 site in tRNAleu region of mitochondrial DNA(mtDNA) with tumorigenesis and p53 mutation.Methods The whole DNA was extracted from carcinoma and adjacent tissues of 28 patients with liver carcinoma and 35 patients with colon cancer.Then tRNAleu region of mtDNA and p53 gene were amplified by PCR and sequenced.Results No T→C mutation was found in 3264 site，but 16 cases of mutations in the other sites were discovered in the carcinoma tissues.No T→C mutation was found in 3264 site，but 3 cases of mutations were discovered in the adjacent tissues.Seventeen cases of p53 gene mutation were found in the carcinoma tissues; 9 cases of p53 mutation were found in patients with colon carcinoma，including 6 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05) ; and 8 cases of p53 mutation were found in patients with liver cancer，including 5 cases of tRNAleu mutation and 3 cases of non-tRNAleu mutation(P＜0.05).Conclusions The T→C mutation in 3264 site of tRNAleu region can't be considered to have relationship with tumorigenesis.The mutations in other sites of tRNAleu region are due to p53 mutation，so the gene loses its protection，and thus the mutation occurs.

Key words:colonic carcinoma; liver carcinoma; mitochondria; p53; sequence of tRNAleu region; mutation

(收稿日期:2014-06-17)

通信作者簡介:郭洪亮(1963-)，男，主任醫師，研究員，主要研究方向為大腸癌及胃癌的基礎與臨床。E-mail: hliangbb@163.com

作者簡介:第一王賁士(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向為大腸癌的基礎與臨床。E-mail: wangbishi1521@163.com

基金項目:國家十二五重大專項(2012ZX10001004-002) ;國家科技支撐計劃課題(2012BAI15B00) ;“十二五”艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(2012ZX10001-003-003) ;山東省醫學科學院級科技計劃(2014-24)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0007-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R73; Q343.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.003