苯甲醛左氧氟沙星席夫堿誘導人肝癌細胞凋亡作用

霍　菲，唐乃夫，范媛媛，劉詩濛，張　瑩，梁紅霞，胡國強，劉　彬

(河南大學1.護理學院神經生物學研究所、2.淮河臨床學院、3.藥學院，河南開封　475004)

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苯甲醛左氧氟沙星席夫堿誘導人肝癌細胞凋亡作用

霍菲1，唐乃夫1，范媛媛1，劉詩濛2，張瑩2，梁紅霞1，胡國強3，劉彬1

(河南大學1.護理學院神經生物學研究所、2.淮河臨床學院、3.藥學院，河南開封475004)

摘要:目的研究苯甲醛左氧氟沙星席夫堿化合物對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的誘導作用。方法用不同濃度的(S) -1，8-(2-甲基亞乙氧基) -6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基) -3-［S-芐基硫基-4-(對硝基苯甲叉基氨基) -1，2，4-均三唑-3-基］-喹啉(1-H) -4-酮(M18)與SMMC-7721細胞、人乳腺癌細胞MB-231、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HEPG-2和小鼠骨髓間充質干細胞體外培養。MTT法檢測M18對各種細胞的生長抑制作用; Hoechst 33258熒光染色法、TUNEL法檢測細胞凋亡變化;高內涵活細胞成像系統測定細胞線粒體膜電位(△ψm)變化; Western blot方法測定caspase-3、p53蛋白表達量的改變，以及細胞色素C在線粒體內外的分布。結果M18在4～32 μmol·L(－1)的濃度范圍內能明顯抑制SMMC-7721細胞、MB-231細胞、HCT-116細胞、HEPG-2細胞增殖，呈濃度、時間依賴關系，作用于細胞24 h的IC(50)值分別為8.65、9.37、12.74和9.40 μmol·L(－1);左氧氟沙星鹽酸鹽作用于SMMC-7721細胞24 h的IC(50)值為735.10 μmol· L(－1)，M18作用于骨髓間充質干細胞24 h的IC(50)值為38.96 μmol·L(－1);不同濃度M18作用人肝癌SMMC-7721細胞24 h，細胞凋亡率高于對照組(P＜0.05)。M18作用于SMMC-7721細胞后，細胞線粒體膜電位降低，與對照組相比差異有統計學意義; M18明顯增加SMMC-7721細胞的p53和caspase-3蛋白表達量，其中caspase-3活性裂解片段增加明顯; M18作用使細胞線粒體內細胞色素C明顯減少，胞質內細胞色素C明顯增加。結論苯甲醛左氧氟沙星席夫堿能夠誘導人肝癌細胞凋亡，作用與線粒體凋亡通路有關。

關鍵詞:氟喹諾酮席夫堿;肝癌細胞;細胞增殖;凋亡;線粒體膜電位; p53

氟喹諾酮羧酸是一類廣泛應用于臨床的化學合成抗菌藥物，作用靶點是細菌的DNA回旋酶(gyrase)，抑制細菌增殖［1］。真核生物的拓撲異構酶Ⅱα和Ⅱβ的一級結構序列與細菌的回旋酶非常相似，其中拓撲異構酶ⅡN端結構域(1-670氨基酸)與DNA回旋酶的B亞基(GyrB)具有同源性。拓撲異構酶Ⅱ的中部結構域(671-1200氨基酸)與DNA回旋酶的A亞基(GyrA)具有同源性，結構中包含的酪氨酸活性位點對催化DNA斷裂和再連接十分必要［2］。目前，已有多種臨床應用抗腫瘤藥物的作用靶酶是拓撲異構酶Ⅱ［3］。部分抗菌氟喹諾酮羧酸對真核細胞增殖有較弱的抑制作用，例如環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等［4］。課題組的前期研究結果顯示，將氟喹諾酮羧酸的C-3羧基與酰腙類化合物結合所合成的新型氟喹諾酮衍生物對拓撲異構酶Ⅱ具有較強的抑制作用［5－6］，促進拓撲異構酶Ⅱ介導的PBR332質粒DNA解旋和斷裂，抑制DNA再連接反應，作用與臨床應用的拓撲異構酶Ⅱ毒劑依托泊苷一致［7－8］。本研究以左氧氟沙星為先導化合物，用12種結構單元替代左氧氟沙星分子結構的C-3羧基，合成一系列左氧氟沙星C-3酰腙衍生物。其中苯甲醛左氧氟沙星席夫堿(S) -1，8-(2-甲基亞乙氧基) -6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基) -3-［S-芐基硫基-4-(對硝基苯甲叉基氨基) -1，2，4-均三唑-3-基］-喹啉(1-H) -4-酮(M18，Fig 1)活性最強，IC50值達8.65 μmol·L－1，具有進一步研究開發的價值。

Fig 1　Structure of(S) -1，8-(2-methyl phosphate ethoxy) -6-fluorine-7-(4-methyl-piperazine-1-base) -3-［S-benzyl s－based-4-(for nitrobenzene methylene group amino) -1，2，4-all triazole-3-base］-quinoline (1-H) -4-ketone

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1誘導劑苯甲醛左氧氟沙星席夫堿由河南大學化學生物學研究所設計、改造并合成，HPLC法測定純度＞99%，溶解在二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司)中，濃度為1×10－2mol·L－1。

1.1.2細胞株和主要試劑人肝癌細胞系SMMC-7721和HEPG-2、人乳腺癌細胞MB-231、人結腸癌細胞HCT-116購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，生長在含體積分數為0.1的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培養基(Gibco公司)中，置體積分數為0.05的CO2、37℃恒溫培養。

四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DeadEndTMFluorometric TUNEL System(Promega公司) ;線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司) ; caspase-3、p53、細胞色素C抗體(Cell Signaling Technology) ;β-actin抗體、HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG(中杉金橋公司) ; Hoechst 33258 (Sigma公司)。其余試劑為國產分析純產品。

1.1.3主要儀器二氧化碳培養箱(Thermo Forma，3121，USA) ;酶標儀(Thermo Multiskan Ascent，USA) ; BX51熒光顯微鏡(Olympus公司) ; DYY-7C型轉移電泳儀、垂直電泳儀、半干式電轉裝置、凝膠成像系統(北京六一儀器廠) ;高內涵活細胞成像系統(Thermo Fisher Scientific，USA)。

1.2方法

1.2.1MTT法測定藥物對細胞增殖的影響細胞以16×107·L－1濃度接種于96孔細胞培養板，加入不同濃度的M18，分別培養24、48、72 h后吸去培養液，每孔加入DMSO 0.15 ml振蕩10 min，至藍色結晶完全溶解，酶標儀測570 nm吸收度(A)值并計算抑制率。以含等體積的培養液和DMSO的無細胞孔測的吸光度值為空白對照。根據中效方程式［fa/fu=(D/Dm) m］計算出中效濃度(IC50)［9］。細胞生長抑制率/%=［1－(處理組吸收度－空白對照組吸收度)/(對照組吸收度－空白對照組吸收度)］×100%。

1.2.2骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分離培養法取C57BL/6J小鼠兩只，6～8周齡。在無菌條件下迅速取出雙下肢骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液沖洗骨髓腔，再用4號針頭吹打細胞制成單細胞懸液，按照600×107·L－1到800×107·L－1的密度接種至培養瓶中，培養48 h后，每3天更換培養液，細胞密度達80%后傳代培養。

1.2.3Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡形態變化

細胞以1×108·L－1濃度接種于放置蓋玻片的6孔板，待細胞貼壁后，加入不同濃度的M18培養24 h，PBS洗2次，多聚甲醛固定15 min，30 μL Hoechst 33258工作液于蓋玻片上，室溫染色10 min。PBS漂洗2次，中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.4TUNEL法測定細胞凋亡率取1×108·L－1細胞數接種細胞于放置蓋玻片的6孔板，用不同濃度的M18作用24 h，按Promega公司的試劑盒說明書操作，檢測細胞凋亡率。

1.2.5線粒體膜電位(△ψm)測定以8×107· L－1的濃度接種細胞到6孔板，用不同濃度的M18培養24 h，每孔加入1 mL的Rh-123稀釋液1 h，PBS 洗3遍，加入終濃度為5 mg·L－1的Hoechst 33342避光染色10 min，PBS洗滌，高內涵活細胞成像系統觀察分析。

1.2.6線粒體蛋白的分離常規收集經不同濃度M18作用24 h的細胞，12 000 r·min－1離心10 min，PBS洗滌，按照細胞線粒體分離試劑盒說明書提取細胞線粒體蛋白與胞質蛋白。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達不同濃度M18作用細胞24 h，RIPA裂解液200 μL充分裂解細胞，4℃離心(12 000 r·min－1) 5 min提取蛋白，考馬斯亮藍G250法分光光度計測樣品蛋白濃度，12% SDSPAGE電泳分離。電轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶2 000) 4℃封閉過夜，二抗(HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體1∶4 000)孵育1 h，化學發光法顯示結果，凝膠圖像分析系統拍照。

1.3統計學分析所有資料均采用SPSS 14.0軟件包進行統計學處理。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗分析。

Fig 2 Proliferation inhibition effect of M18 and levofloxacin on human cancer cells and BMSCs

2　結果

2.1M18對各種腫瘤細胞和小鼠骨髓間充質干細胞增殖的抑制作用不同濃度的M18分別作用于SMMC-7721、MB-231、HCT-116和HEPG-2細胞24、48 和72 h，M18對腫瘤細胞有較強增殖抑制作用，并呈時間與濃度依賴關系，24 h的IC50值分別是8.65 μmol·L－1(r2=0.8841)、9.37 μmol·L－1(r2=0.8523)、12.74 μmol·L－1(r2=0.7994)和9.40 μmol ·L－1(r2=0.8218) ; M18分別作用于骨髓間充質干細胞24、48和72 h，對細胞的增殖抑制作用不明顯，24 h的IC50值為38.96 μmol·L－1(r2=0.7822) ; M18合成原料左氧氟沙星對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響不明顯，24 h的IC50值為735.10 μmol·L－1(r2=0.6854) (Fig 2)。

2.2M18誘導SMMC-7721細胞凋亡作用Hoechst 33258染色結果顯示，M18作用于SMMC-7721細胞24 h，出現細胞膜皺縮、染色質凝集、核呈碎片狀等凋亡形態學變化(Fig 3)。TUNEL結果顯示，隨著M18濃度增加，凋亡細胞明顯增多，呈濃度依賴性(Fig 4，Tab 1)。

Fig 3 SMMC-7721 cell apoptosis under fluorescent microscope stained by Hoechst 33258 (×200)

2.3M18對線粒體膜電位的影響Rh-123熒光強度可以間接反映線粒體膜的破壞程度。M18作用于SMMC-7721細胞24 h，隨著化合物濃度增加，熒光強度逐漸增大，表明細胞線粒體膜電位降低，與對照組比較，分別降低(8.97±4.15) %、(31.82±5.29) %、(47.25±6.03) %，差異有統計學意義(P＜0.01)，見Fig 5。

2.4M18對p53、caspase-3蛋白表達和細胞色素C線粒體內外分布的影響以2.467、8.650、26.401 μmol·L－1M18分別作用于SMMC-7721細胞24 h，Western blot法檢測p53、caspase-3的表達和細胞色素C線粒體內外分布。與對照組相比，M18作用后細胞p53蛋白表達明顯增加，呈明顯的濃度依賴關系，caspase-3蛋白表達量增多，活性片段增多。細胞線粒體內細胞色素C分布降低，細胞質內細胞色素C分布增多，提示M18誘導SMMC-7721細胞凋亡作用可能與線粒體凋亡通路有關，見Fig 6。

Fig 4 Induction of apoptosis of SMMC-7721 cells treated with M18 for 24 h evaluated by TUNEL assay

Tab 1 Apoptotic effects of M1?8 on SMMC-7721 cells (±s，n=9)

Tab 1 Apoptotic effects of M1?8 on SMMC-7721 cells (±s，n=9)

*P＜0.05 vs control

Group　Dose/μmol·L－1Apoptotic ratio/% Control　0.0113±0.00418 M18　2.476　0.1950±0.01586*8.650　0.3822±0.03639*26.401　0.5306±0.06966*

3　討論

Fig 5 Changes in MMP of SMMC-7721 cells induced by M18 for 24 h and analyzed by HCS after staining with Rh-123

部分臨床常用的氟喹諾酮類抗菌藥物對真核細胞的拓撲異構酶Ⅱ有較弱的抑制作用［10］。研究發現，氟喹諾酮羧酸C-3位羧基對抗菌活性必需，對抗腫瘤活性并非必要，為尋找新型抗腫瘤氟喹諾酮候選物提供思路［11－12］。本課題組以左氧氟沙星為底物，用結構單位替代C-3位羧基，合成12種左氧氟沙星衍生物，用MTT法檢測12種喹諾酮類衍生物對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用，多數化合物顯示出對SMMC-7721細胞的不同程度生長抑制作用，IC50值在50 μmol·L－1以下，其中M18對細胞的增殖抑制作用效果最好，24h的IC50值達8.65 μmol· L－1，其合成原料左氧氟沙星對SMMC-7721細胞增殖的影響不明顯，IC50值達735.10 μmol·L－1，說明化合物改造符合理論推測，具有較好的研究開發價值。為了解M18對各種腫瘤組織作用的差異，本研究選用4種不同類型的腫瘤細胞株(結腸癌HTC-116細胞、乳腺癌MB-231細胞、人肝癌HEPG-2細胞、人肝癌SMMC-7721細胞)，檢測M18對細胞的生長抑制作用。結果證明，M18對多種腫瘤細胞均有明顯增殖抑制作用，并呈時間與濃度依賴性。本研究同時應用原代培養骨髓間充質干細胞，檢測M18的細胞生長抑制作用，IC50值為38.96 μmol· L－1，明顯高于M18對SMMC-7721細胞作用的IC50值。說明M18對腫瘤細胞具有較好的選擇性，在未來臨床應用中可能具有較小的毒副作用。

本課題組前期實驗已經證明，經C-3羧基改造的氟喹諾酮衍生物的作用靶點是DNA拓撲異構酶Ⅱ，造成腫瘤細胞的DNA損傷，這種作用可能激活p53蛋白，誘導細胞凋亡［13－14］。本實驗應用Western blot法檢測p53表達量的改變，提示M18殺傷SMMC-7721細胞的作用可能通過DNA損傷，p53增加，進而誘導細胞進入凋亡途徑。應用Hoechst 33258熒光染色法觀察SMMC-7721細胞核形態變化，觀察到M18作用24h凋亡SMMC-7721細胞增加，表現為細胞核染色質凝集、核邊移、核碎裂，出現凋亡小體等凋亡細胞核形態學改變。TUNEL法顯示，隨著M18濃度增加，細胞凋亡率明顯升高。Western blot結果也證明，隨著M18濃度的增加，caspase-3表達量增多，裂解片段增加。說明通過激活caspase-3途徑誘導細胞凋亡［15］。從理論上推測，p53介導的凋亡通路以線粒體凋亡通路為主。本研究用M18導致SMMC-7721細胞線粒體內細胞色素C流出，線粒體膜電位下降，說明M18誘導細胞凋亡主要通過線粒體凋亡通路進行。

綜上所述，經改造后的氟喹諾酮衍生物M18明顯抑制腫瘤細胞的增殖，并有較好的選擇抑制作用，M18誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡，此作用與線粒體凋亡通路有關。

Fig 6 Effects of M18 on caspase-3，p53 protein expressions and release of cytochrome C from mitochondria to cytosol in SMMC-7721 cells

參考文獻:

［1］Rhee H K，Park H J，Lee S K，et al.Synthesis，cytotoxicity，and DNA topoisomerase II inhibitory activity of benzofuroquinolinediones［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(4) :1651－8.

［2］McClendon AK，Osheroff N.DNA topoisomerase II，genotoxicity，and cancer［J］.Mutat Res，2007，623(1－2) : 83－97.

［3］Pogorelˇcnik B，Perdih A，Solmajer T.Recent developments of DNA poisons-human DNA topoisomerase IIα inhibitors-as anticancer agents［J］.Curr Pharm Des，2013，19(13) : 2474－88.

［4］Williams G M，Brunnemann K D，Smart D J，et al.Relationship of cellular topoisomerase IIalpha inhibition to cytotoxicity and published genotoxicity of fluoroquinolone antibiotics in V79 cells［J］.Chem Biol Interact，2013，203(2) : 386－90.

［5］Shi Z Y，Li Y Q，Kang Y H，et al.Piperonal ciprofloxacin hydrazone induces growth arrest and apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33(2) : 271－8.

［6］付建民，王德輝，孫金平，等.對甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用［J］.中國藥理學通報，2011，27(6) :801－5.

［6］Fu J M，Wang D H，Sun J P，et al.p-Methoxycinnamaldehyde levofloxacin-3-ylhydrazone induces apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27 (6) : 801－5.

［7］Sun J P，Shi Z Y，Liu S M，et al.Trimethoxy-benzaldehyde levofloxacin hydrazone inducing the growth arrest and apoptosis of human hepatocarcinoma cells［J］.Cancer Cell Int，2013，13(1) : 67.

［8］任爭，康玉華，石貞玉，等.肉桂醛氧氟沙星酰腙誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用［J］.藥學學報，2010，45(9) :1109 －15.

［8］Ren Z，Kang Y H，Shi Z Y，et al.Cinnamaldehyde ofloxacin-3-ylhydrazone induces apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Acta Pharm Sin，2010，45(9) : 1109－15.

［9］皇甫超申，馬永超，房娜，等.三氮唑席夫堿衍生物對人肝癌細胞分化和凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(4) : 498－503.

［9］Huangfu C S，Ma Y C，Fang N，et al.Effects of trizole Schiff base derivative on the differentiation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(4) : 498－503.

［10］Kamat A M，DeHaven J I，Lamm D L.Quinolone antibiotics: a potential adjunct to intravesical chemotherapy for bladder cancer ［J］.Urology，1999，54(1) : 56－61.

［11］胡國強，毋曉魁，王新，等.氟喹諾酮C3雜環取代衍生物的合成及抗腫瘤活性研究(I) :環丙沙星噻二唑希夫堿［J］.藥學學報，2008，43(11) :1112－5.

［11］Hu G Q，Wu X K，Wang X，et al.Synthesis and antitumor activity of C3 heterocyclic-substituted floroquinolone derivatives (I) : ciproflxacin aminothiodiazole Schiff-bases［J］.Acta Pharm Sin，2008，43(11) : 1112－5.

［12］You Q D，Li Z Y，Huang C H，et al.Discovery of a novel series of quinolone and naphthyridine derivatives as potential topoisomerase I inhibitors by scaffold modification［J］.J Med Chem，2009，52(18) :5649－61.

［13］Sheng Z，Cao X，Peng S，et al.Ofloxacin induces apoptosis in microencapsulated juvenile rabbit chondrocytes by caspase-8-dependent mitochondrial pathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008，226(2) :119－27.

［14］Smart D J，Halicka H D，Traganos F，et al.Ciprofloxacin-induced G2 arrest and apoptosis in TK6 lymphoblastoid cells is not dependent on DNA double-strand break formation［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(1) :113－9.

［15］E Kuranaga.Beyond apoptosis: caspase regulatory mechanisms and functions in vivo［J］.Genes Cells，2012，17(2) : 83－97.

Benzaldehyde levofloxacin schiff base induces apoptosis of human hepatocarcinoma cells

HUO Fei1，TANG Nai-fu1，FAN Yuan-yuan1，LIU Shi-meng2，ZHANG Ying2，
LIANG Hong-xia1，HU Guo-qiang3，LIU Bin1
(1.Institute of Neurobiology，College of Nursing，2.Huaihe Clinical College，3.College of Pharmacy，Henan University，Kaifeng Henan 475004，China)

Abstract:AimTo study the effect of (S) -1，8-(2-methyl phosphate ethoxy) -6-fluorine-7-(4-methyl- piperazine-1-base) -3-［S-benzyls-based-4-(for nitrobenzene methylene group amino) -1，2，4-all triazole-3 base］-quinoline(1-H) -4-ketone (M18) on apoptosis of hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro.Methods With different concentrations of M18 at different time used to treat SMMC-7721 cells，human breast cancer MB-231cells，human colon cancer HCT-116 cells，human hepatocarcinoma HEPG-2 cells，mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro，the inhibition effects of M18 on cell proliferation were examined by MTT assay.Cell apoptosis was determined using Hoechst 33258 fluorescence staining and TUNEL method.Mitochondrial membrane potential (△ψm) was measured using a high content screening image system.Protein expression of caspase-3，p53 and cytochrome C was detected with Western blot analysis.ResultsTreatment with M18 (4～32 μmol·L(－1)) potently inhibited the proliferation of the cancer cells in time-and dose-dependent manners (the IC(50)value at 24 h in SMMC-7721 cells，MB-231cells， HCT-116 cells and HEPG-2 cells was 8.65 μmol· L(－1)，9.37 μmol·L(－1)，12.74 μmol·L(－1)and 9.40 μmol·L(－1)，respectively).In contrast，M18 had weak cytotoxicity against BMSCs with IC(50)value of 38.96 μmol·L(－1).Levofloxacin had weak cytotoxicity against SMMC-7721 cells with IC(50)value of 735.10 μmol·L(－1).Treatment of SMMC-7721cells with different concentrations of M18 for 24 h increased the percentage of the apoptosis cells (P＜0.05) and decreased the mitochondrial membrane potential.In addition，M18 increased protein expression of p53，caspase-3 and the cleaved activated forms of caspase-3 in SMMC-7721 cells.Treatment of SMMC-7721 cells with M18 significantly increased cytochrome C in the cytosol，and decreased cytochrome C in the mitochondrial compartment.ConclusionThe mitochondrialdependent pathways are involved in M18 induction of apoptosis of SMMC-7721 cells.

Key words:fluoroquinolones schiff base; hepatocarcinoma cells; cell proliferation; apoptosis; mitochondrial membrane potential; p53

作者簡介:霍菲(1990－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤分子藥理學，E-mail: 805767095@ qq.com;劉彬(1959－)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向:腫瘤分子生物學，通訊作者，Tel: 0371-23880399，E-mail: lbgood5912@ sina.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 21072045) ;河南省科技廳科技攻關重點項目(No 112102310307)

收稿日期:2015－01－25，修回日期:2015－03－20

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0821－06中國圖書分類號: R329.25; R735.702.2; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.017