表沒食子兒茶素沒食子酸酯調控CDC25A表達與抑制食管癌細胞增殖作用及機制

張利宣，曲 藝

（1.河北醫科大學第三醫院，河北 石家莊 050000； 2.河北省醫學情報研究所，河北 石家莊 050000）

食管癌是較常見的惡性腫瘤［1］，旺盛的增殖能力及無控性生長是惡性腫瘤的共同特點，研究食管癌的發生機制對于食管癌早期診斷及治療具有重大意義。筆者利用流式細胞術檢測食管鱗癌細胞增殖及細胞分裂周期（cell division cycle，CDC）25A蛋白表達水平，探討細胞增殖與食管癌發生及發展的關系，利用細胞試驗研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）抑制食管癌細胞Ec9706增殖及調控CDC25A蛋白作用，以期為臨床研究低毒、高效的抗食管癌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑與儀器、細胞株：EGCG（美國Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；碘化丙啶（美國Sigma公司）。鼠抗人CDC25A單克隆抗體（克隆系 DCS-120，美國 Santa Cruz公司）。Epics-XL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。人食管癌Ec9706細胞株（由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈，本實驗室傳代培養）。接種細胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培養基中（補充青霉素、鏈霉素各100 U/L），培養器皿置37℃含5%CO2的細胞培養箱中。

臨床標本：選取河北醫科大學第四醫院病理科2005年9月至2006年5月手術切除食管癌標本38例，患者術前均未經任何抗癌治療，均有完整的病理資料。其中男22例，女16例；年齡40～76歲；經病理醫師證實均為進展期食管鱗狀細胞癌。另取20例切緣正常食管黏膜組織作為對照。標本用70%乙醇固定。

1.2 方法

單細胞懸液制備：將食管癌或正常組織利用網搓法制備單細胞懸液，顯微鏡下觀察細胞形態，保證細胞完整細胞好，細胞碎片少，調整細胞懸液濃度為1×107/mL。

分組及藥物干預：取對數生長期的Ec9706細胞1×106接種至細胞培養瓶中，待細胞貼壁后，加入不同質量濃度的EGCG，使終質量濃度分別達到 0，100，200，300mg/L，對照組使用生理鹽水代替EGCG（即0mg/LEGCG），作用24 h后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，300目尼龍網過濾制備成合格的單細胞懸液，調整細胞懸液濃度為1×107/mL，70%乙醇固定，4℃冰箱放置備檢。每組試驗重復3次。

細胞增殖檢測：Epics-XLⅡ型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），激發光源為15mW氬離子激光器，激發波長為488nm，應用Expo 32 ADC分析免疫熒光數據，用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析。檢測前以flow-check TMF luorpheres（10 μm）熒光微球 （REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835.）作為標準樣品調整儀器CV值在2%以內。取上述制備的單細胞懸液100μL（含1×106細胞）。冷PBS洗滌細胞1次，去上清，向細胞中加入碘化丙啶500μL，4℃冰箱內避光染色30min，冷PBS洗滌細胞1次，去上清，加1mL PBS懸浮細胞，上流式細胞儀檢測。細胞增殖狀態以增殖指數（proliferation index，PI）表示，PI＝ （S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。

細胞CDC25A蛋白表達檢測：取制備的單細胞懸液100μL（含1×106細胞），PBS洗滌1次，去上清，向其中加入CDC25A抗體100μL，避光室溫放置30 min，PBS洗滌細胞1次，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100μL，避光室溫孵育30min，PBS洗滌細胞1次，上機檢測前加入PBS 1 mL，經500目銅網過濾后上流式細胞儀檢測。CDC25A蛋白表達以平均熒光強度表示。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 食管癌及正常組織細胞增殖及CDC25A蛋白表達水平

食管癌細胞增殖指數為（24.92±11.01）%，與食管正常組織細胞增殖指數（14.49 ±3.83）%相比顯著增高（P＜0.05），見圖 1。食管癌組織細胞中CDC25A蛋白表達量為（558.201 5±45.673 8）%，與食管正常組織細胞中CDC25A蛋白表達量（508.802 4±53.322 7）%相比顯著增高（P＜0.05），見圖 2。

圖1 流式細胞術檢測不同食管組織細胞周期

圖2 流式細胞術檢測不同食管組織細胞中CDC25A蛋白表達量

2.2 EGCG作用后Ec9706細胞增殖及CDC25A蛋白表達水平

100，200，300mg/LEGCG 作用 24 h后，Ec9706細胞增殖指數分別為（34.14 ±2.06）%，（25.66 ±1.68）%，（18.32 ±1.07）%，與對照組 （41.24±1.13）% 相比顯著降低（P＜ 0.05）。300 mg/L EGCG組細胞增殖指數顯著低于 100，200 mg/L EGCG組（P＜0.05）。100，200，300mg/LEGCG 作用 Ec9706 細胞 24 h 后，細胞中 CDC25A蛋白表達量分別為 （574.31±4.61）% ，（551.59±6.10）%，（532.70 ±6.42）%，與對照組（595.87 ±3.73）%相比顯著降低（P＜0.05）。300mg/LEGCG組細胞中CDC25A蛋白表達量顯著低于 100，200mg/LEGCG 組（P＜0.05）。

3 討論

細胞增殖的紊亂在惡性腫瘤的發生中起著一定作用。細胞增殖受一系列因子的調控［2-3］，細胞周期調控的核心是一組蛋白激酶，即細胞周期蛋白依賴性激（CDKs）［4-5］。它們各自在細胞周期內特定的時間激活，通過對相應底物磷酸化，驅使細胞完成細胞周期。CDKs的激活首先需與cyclin結合成cyclin/CDK復合物，此外還受到幾種復雜機制的嚴格調控，包括細胞周期蛋白（cyclin）、CDK 激活性激酶 （CAK）機制、CDK 抑制物（CKI）機制和Weel/CDC25 機制等［6］。CDC25A是 CDC25 家族成員，研究表明CDC25A在多種腫瘤細胞中高表達，如卵巢癌、乳腺癌等，被認為是癌基因，在細胞周期G1至S期和G2至M期中發揮作用［7-8］。CDC25A過度表達可導致細胞生長失控后惡性轉化［9］。本試驗結果顯示，食管癌細胞增殖呈旺盛狀態，且CDC25A蛋白過度表達，提示CDC25A蛋白高表達可能是引起食管癌細胞增殖旺盛的原因之一，并參與了食管癌的發生。

食管癌目前的主要治療方法包括手術、放射治療及化學治療，手術往往是首選的治療方法，但對于中晚期或由于其他原因不能手術的患者，多選擇放射、化學治療。由于化學治療藥物的高毒副作用及易耐藥，效果不佳，故尋找高效低毒的抗食管癌藥物，顯得格外重要。近年來的研究發現，EGCG是綠茶的提取物，具有低毒副作用的特點，EGCG對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用［10］，但用于食管癌的研究尚少見。本試驗結果發現，EGCG作用后食管癌細胞增殖受抑制，提示EGCG可以抑制食管癌細胞生長，且可以下調CDC25A的表達水平。EGCG可能通過下調食管癌Ec9706細胞中CDC25A表達，從而抑制食管癌細胞生長，起到抗食管癌作用，且EGCG具有低毒副作用的特點，可作為抗食管癌藥物開發，具有廣泛的應用前景。

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