反相高效液相色譜法同時測定大鼠血清中多索茶堿和甲潑尼龍的質量濃度*

陳 菲，王建美，盛柳青，裘穎兒

（1.金華職業技術學院醫學院，浙江 金華 321000； 2.浙江省金華食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000）

慢性阻塞性肺疾病是老年患者呼吸道的常見病和多發病，患病率和病死率均高，世界衛生組織報告其占全球所有疾病死因的第4位，每年大約有270萬人死于該病，我國為128萬［1-2］。多索茶堿和甲潑尼龍是臨床常用的治療慢性阻塞性肺疾病發作的藥物。多索茶堿是一種具有抗炎和支氣管擴張作用的新一代甲基黃嘌呤衍生物，可通過抑制平滑肌細胞內的磷酸二酯酶發揮松弛支氣管平滑肌的作用；甲潑尼龍是人工合成的中效糖皮質激素，具有較強的抗炎活性且在肺部的血藥濃度較高，能減輕患者急性炎癥和氣道阻塞；早期聯合使用這兩種作用機制不同的藥物，可有效控制慢性阻塞性肺疾病的各種癥狀［3-4］。多索茶堿的代謝受多種因素及藥物的影響，甲潑尼龍作為激素類藥物與多種藥物存在相互作用的可能，而兩者作為臨床常見的聯用藥物，其藥代動力學、相互作用卻未見文獻報道。本試驗中以大鼠為研究對象，針對兩者理化性質差異較大的特點，以氫化可的松為內標，采用單一流動相，建立了可同時測定兩者血藥濃度的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥、動物

Waters2487型高效液相色譜儀（美國Waters公司），2487紫外檢測器，Breeze色譜工作站，20μL自動進樣閥；WH-90A型微型旋渦混合器（上海振榮科學儀器有限公司）；TDL80-2型離心沉淀器（上海手術器械廠）；1004型電子天平（上海天平儀器廠）；ACS-3型電子計價秤（金華市征龍衡器有限公司）。多索茶堿對照品（批號為100625-201202），甲潑尼龍對照品（批號為100828-200501），氫化可的松對照品（批號為 100152-200206），均由中國藥品生物制品檢定所提供；水為重蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。SD大鼠，清潔級，雄性，體重250～300 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物試驗許可證號為SCXK＜浙＞20140001）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150mm ×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.5% 醋酸溶液（54 ∶46）；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0mL /min；進樣量：20 μL；內標物：氫化可的松。

2.2 標準溶液配制

分別精密稱取多索茶堿25mg和甲潑尼龍15mg，加甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，得含質量濃度為1.0 g/L及0.6 g/L的標準貯備液。精密稱取氫化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，得質量濃度1.0 g/L的內標貯備液。將多索茶堿和甲潑尼龍標準貯備液用甲醇梯度稀釋為質量濃度分別為400，200，100，50，20，10，5 μg /mL 和 240，120，60，30，12，6，3 μg /mL的標準溶液。

2.3 血清樣品處理［5］

采集大鼠空白血液，置未加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min低溫離心5min，分離得空白血清。精密量取空白血清1.0mL，加1.0 g/L的內標貯備液50μL，用甲醇稀釋至5.0 mL，渦旋混合1min，4 000 r/min離心15min，取上清液過濾，得血清樣品。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：按擬訂色譜條件，取大鼠空白血清、空白血清+對照品+內標溶液，依法測定。結果多索茶堿、甲潑尼龍和氫化可的松的保留時間分別為3.761，22.099，13.177min，三者分離良好，且血清中的內源性物質對待測物出峰也不造成干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密量取空白血清1.0mL，加入多索茶堿和甲潑尼龍的系列標準溶液各0.5mL，按2.3項下方法操作得不同質量濃度（含多索茶堿 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μg /mL和甲潑尼龍 0.3，0.6，1.2，3.0，6.0，12.0，24.0 μg /mL）的血清對照品共7份。按擬訂色譜條件測定峰面積，分別以待測物峰面積與內標物峰面積的比值（Y）對待測物和內標物質量濃度（X）進行線性回歸。得多索茶堿的回歸方程 Y＝0.109 4X+0.005 3，r＝0.999 5；甲潑尼龍的回歸方程 Y＝0.175 2X-0.037 2，r＝0.9996。結果表明，多索茶堿和甲潑尼龍質量濃度在0.5～40μg/mL和0.3～24μg/mL（n＝7）范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗：在空白血清中加入一定量的待測物的標準溶液，制備高、中、低3個質量濃度待測物的標準血清樣品（含多索茶堿和甲潑尼龍分別為 30.0，7.5，1.0 μg/mL 和 20.0，5.0，0.5μg/mL）各5份，按2.3項下方法操作。在24 h內連續測定5次，計算日內精密度；連續測定3 d計算日間精密度。結果見表1，日內和日間 RSD均小于10%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結果（n＝5）

穩定性試驗：取血清樣品，在室溫放置6 h，或經過3個冷凍-解凍循環，或-20℃條件下冷凍保存1個月。以待測物測定的質量濃度與實際質量濃度之間的 RSD作為考察指標，其 RSD分別為5.52%，7.13%，4.89%（n＝5），表明處理過的血清樣品具有良好的穩定性，血清樣品凍融3次和冷藏1個月基本保持穩定。

加樣回收試驗：制備含多索茶堿和甲潑尼龍質量濃度分別為10μg/mL和 6μg/mL的血清樣品 6份，分別加入多索茶堿（400 μg/mL）和甲潑尼龍（240 μg/mL）標準溶液 100，125，150 μL，平行測定2份，按2.3項下方法操作，計算加樣回收率［6-7］。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）

3 討論

對于同時測定理化性質差異較大的藥物，文獻報道多集中在采用HPLC梯度洗脫，或采用2種流動相分別洗脫［8-9］，而本方法只采用單種流動相洗脫，從方法上來說更簡便快速。本方法的建立，不僅為研究多索茶堿和甲潑尼龍的藥代動力學、藥物相互作用提供了技術基礎，也為建立同時檢測其他理化性質存在較大差異的聯用藥物的血藥濃度方法提供了參考。

檢測波長的選擇：對多索茶堿和甲潑尼龍的甲醇溶液在200～400nm的波長范圍內進行紫外掃描，發現多索茶堿在272nm、甲潑尼龍在243 nm波長處有最大吸收峰。綜合考慮2個待測物的靈敏度、內標物的響應和血清內源性雜質等影響因素，最終選定260 nm為檢測波長。

流動相的選擇：對甲醇-水系統與乙腈等其他試劑進行比較，因甲醇廉價易得且安全性較高，對儀器以及色譜柱損害程度小，選擇前者；結合多索茶堿和甲潑尼龍的極性相差較大因素，在甲醇∶水（30%→70% ∶70%→30%）范圍內試驗，進行加酸篩選，最后選定甲醇-0.5%醋酸溶液（54∶46）為流動相。

內標物的選擇：因生物樣品的藥物濃度低，故采用內標法。本試驗中對咖啡因、地塞米松、氫化可的松、苯巴比妥、非那西丁、炔諾酮等候選內標物進行了篩選［10］，最后選定保留時間剛好在2種待測物之間、分離良好且在檢測波長處響應較好的氫化可的松作為內標物。

生物樣品的選擇：對空白血漿和空白血清的色譜圖進行了分析，發現空白血漿的內源性雜質比空白血清多，特別是在保留時間為5.5min時附近有一較強的吸收峰，且與多索茶堿的吸收峰較為接近，因此選擇內源性干擾較少的空白血清作為生物樣品。

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