急性冠脈綜合征患者基質金屬蛋白酶-9水平及與炎癥因子相關性研究

閆 杰，鄭 霞

心血管疾病是威脅人類健康最常見的疾病之一，其中急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes，ACS)發病率及死亡率有上升及日趨年輕化的趨勢［1］。ACS包括急性心肌梗死(acute myocardia1 infarction，AMI)、不穩定型心絞痛(unstab1e angina，UA)和猝死。其診斷很大程度上要依賴于患者的臨床表現、心電圖和心肌損傷標記物。目前使用的心肌損傷標志物包括肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I，但它們僅在心肌細胞發生不可逆損害以及細胞膜的完整性被破壞之后才能被檢出，因此，不利于早期心肌損傷可逆階段的診斷［2－3］。細胞外基質降解增加和合成減少以及冠狀動脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應是導致斑塊不穩定繼而引發ACS的主要因素。細胞外基質中基質金屬蛋白酶(matrix meta11oproteinases，MMPs)是一類與斑塊不穩定及破裂關系十分密切的蛋白水解酶類［4］。在防治動脈粥樣硬化的過程中，適度地抑制MMPs活性可以提高斑塊的穩定性，減少斑塊破裂的發生。MMPs活性調節是一個十分復雜的過程，涉及多種刺激及抑制因素，目前對其了解還不十分全面。但適度地調節MMPs活性，改善細胞外基質重構將成為動脈粥樣硬化防治研究的方向之一。有研究發現在不穩定斑塊易發生破裂的肩部MMP－9的活性增加，MMP－9是造成斑塊不穩定引發ACS的主要降解酶之一［2］。筆者主要研究ACS患者MMP－9 水平與腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細胞介素－6(inter1eukin－6，IL－6)、白細胞介素－1β(inter1eukin －1β，IL－1β)等炎癥刺激因子的相關性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超凈工作臺(上海躍進器械一廠型號:HHw21);CU600低溫離心機、無菌吸管、滴管、低溫冰箱，MMP－9、TNF－α、IL－6、IL－1β 等試劑盒均購自北京北方生物技術研究所。

1.2 實驗對象及分組 選擇2009年3月至2012年1月本院心內科收治的冠心病患者90例，并選健康對照組30例。AMI組30例，診斷標準:(1)缺血性胸痛持續≥30 min，用硝酸甘油癥狀不緩解;(2)相鄰2個或更多導聯ST段抬高，肢體導聯≥0.1 mV，胸導聯≥0.2 mV;(3)心肌酶動態變化。具有以上任何2項確診。AMI患者必須為發病6 h以內。UA組30例，診斷標準:近48 h內有靜息或自發心絞痛發作至少1次，但無心肌壞死的心肌酶譜改變，同時伴有心電圖ST壓低或T波的改變。穩定型心絞痛(stab1e angina，SA)組30例，診斷標準:近3個月心絞痛發作次數、誘發因素、緩解方式均保持穩定，運動實驗陽性。所有患者均排除感染性疾病;高熱及使用炎癥抑制藥物如非類固醇消炎鎮痛藥、類固醇;貧血;腫瘤;甲狀腺機能亢進及結締組織病;心功能不全;外周血管疾病或外周動脈硬化病;嚴重肝腎功能不全等。每例ACS患者均行冠狀動脈造影術，明確病變后對血管行經皮腔內冠狀動脈成型及支架植入術。對照組30例為同期冠脈造影顯示無明顯局限性狹窄者。各組年齡、性別等比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.3 實驗方法 患者入院即刻留取外周脈血6 m1，靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，取上清液－20℃存儲待測 MMP－9、TNF－α、IL－6 和 IL－1β。MMP－9、TNF－α、IL－6 和 IL－1β 的測定:采用雙抗夾心酶聯免疫吸附(ELISA)法。具體方法步驟如下:(1)將－20℃保存的備檢標本于室溫復融;(2)試劑盒從冰箱取出平衡至室溫，根據說明配置不同濃度的標準品;(3)取出所需板孔，每孔中各加樣品稀釋液100 μ1，第一孔加標準品100 μ1，混勻后用加樣器吸出100 μ1，移至第二孔。如此依次作對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100 μ1棄去，使之體積均為100 μ1，第八孔為空白對照;(4)加樣:待測品孔中每孔加入待測樣品100 μ1;(5)將反應板置于37℃ 120 min;(6)洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，用濾紙印干;(7)每孔中加第一抗工作液50 μ1;(8)將反應板充分混勻后置于37℃ 60 min;(9)洗板:同(6);(10)每孔加酶標抗體工作液100 μ1;(11)將反應板置37℃ 60 min;(12)洗板:同(6);(13)每孔中加入底物工作液100 μ1，置于37℃暗處反應5～10 min;(14)每孔加入1滴終止液混勻;(15)在450 nm處測吸光值;(16)分別計算出 MMP－9、TNF－α 、IL－6 和 IL－1β 的含量;以 OD 值為縱坐標，以標準品為橫坐標，繪制標準曲線。根據樣品的OD值可在標準線上查出其濃度。

1.4 統計學處理 應用SPSS 10.0統計軟件包進行統計分析，主要統計指標均進行正態性檢驗，正態分布的各項統計指標均以均數±標準差(x±s)表示。采用直線相關分析法分析相關指標間相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者血清中 MMP－9、TNF－α 水平 對照組、SA 組與AMI組、UA 組比較MMP－9 、TNF－α 水平差異有統計學意義(P＜0.05);AMI組與UA組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組患者血清中MMP-9、TNF-α水平(ng/L,±s)

表1 各組患者血清中MMP-9、TNF-α水平(ng/L,±s)

注:與對照組及SA組比較aP＜0.05;與UA組比較bP＜0.05。MMP－9 為基質金屬蛋白酶－9，TNF－α 為腫瘤轉移因子－α

組別 例數 MMP－9 TNF－α 30 14.79±6.32 18.7±5.4 SA組 30 16.21±5.74 27.4±3.6 AMI組 30 32.56±6.55ab 61.8±10.8ab UA組 30 24.78±5.76a 41.6±9.1對照組a

2.2 各組患者血清IL－6和IL－1β水平 對照組、SA組與 AMI組、UA 組比較血清 IL－6和 IL－1β 水平差異有統計學意義(P＜0.05)。AMI組與UA組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 各組患者血清IL-6、IL-1β濃度(ng/L，±s)

表2 各組患者血清IL-6、IL-1β濃度(ng/L，±s)

注:與對照組及SA組比較aP＜0.05;與UA組比較bP＜0.05。IL－6 為白細胞介素－6

組別 例數 IL－6 IL－1β 30 30.41±6.32 10.41±3.32 SA組 30 34.81±7.52 26.21±4.33 AMI組 30 53.37±12.70ab 56.78±6.52ab UA組 30 45.33±7.21a 42.73±5.42對照組a

2.3 各組患者 MMP－9、TNF－α、IL－6、IL－1β 相關性分析 對 MMP－9 與 TNF－α、IL－6、IL－1β 分別進行線性相關分析，結果發現 ACS患者 MMP－9與TNF－α 、IL－6顯著相關(r=0.37，0.42，P＜0.05;r=0.45，0.51，P＜0.05)，與 IL－1β 呈弱相關性(r=0.236，0.259，P＜0.05);而 SAP組和對照組 MMP－9 與 IL－6和 IL－1β 無相關性(P＞0.05)。

3 討論

ACS是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，患者的臨床癥狀各異，其冠狀動脈卻具有非常相似的病理學改變，即冠狀動脈粥樣硬化斑塊由穩定轉為不穩定，繼而破裂導致血栓形成［5］。不穩定斑塊主要有以下特點［6］:(1)斑塊內有一個大而松軟的脂質核心;(2)纖維帽薄;(3)活化的炎癥細胞浸潤增強，包括巨噬細胞、泡沫細胞、T淋巴細胞和肥大細胞。在不穩定斑塊破裂過程中，MMPs家族起到重要作用。

MMPs是一類與斑塊不穩定及破裂關系十分密切的蛋白水解酶類，近年來的研究發現，MMPs參與了動脈粥樣時的血管壁重構、斑塊破裂、血栓形成等過程，其與動脈粥樣斑塊的形成、穩定及血栓性疾病等過程密切相關［7］。大量實驗證實巨噬細胞源性的MMPs參與斑塊的破裂［5－8］。肥大細胞和T淋巴細胞活化后，釋放2種中性蛋白酶即胰蛋白酶和食糜酶，它們可激活巨噬細胞分泌 MMPs，其中有MMP－1，MMP－2，MMP－3 和 MMP－9，這些 MMPs 可以降解斑塊纖維帽的所有膠原，使纖維帽變脆弱，引起斑塊破裂。MMP－9是MMPs家族中的一員，是明膠酶的一種，又稱明膠酶B。其為降解細胞外基質所需，參與了人類的各種生理和病理過程，在體內可被多種細胞，如單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、血管平滑肌細胞、以及內皮細胞等分泌。其主要底物包括:明膠、膠原Ⅳ、V和彈性蛋白等。而Ⅴ型膠原是粥樣斑塊基底膜和纖維帽的重要組成部分，因此MMP－9在動脈粥樣硬化斑塊內細胞外基質降解過程中起著重要的作用［9］。斑塊的破裂易發生于纖維帽的邊緣處。這些易破裂的區域含有大量的巨噬細胞，而MMP－9主要存在于巨噬細胞豐富的肩部區域，因此普遍認為這些細胞及其釋放的MMP－9引起斑塊結構的破壞。心肌梗死等急性冠狀動脈綜合征引發的猝死多是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂引起。本次試驗表明，急性冠脈綜合征患者血清中 MMP－9水平明顯增高，說明MMP－9在分解細胞外基質致使不穩定斑塊破裂導致ACS發病中起到了一定的作用。

炎癥反應是斑塊破裂的直接誘因，尸檢發現［9］在不穩定或破裂的動脈粥樣斑塊內聚集著泡沫細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞，且在不穩定偏心斑塊的肩部，炎癥細胞濃度最高，也是最易發生破裂的部位，均提示了炎癥導致斑塊的不穩定、易破裂，在炎癥因子中，TNF－α、IL－6、IL－1β 起重要作用。

TNF是一類能直接造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，TNF－α作為一種前炎性細胞因子，是啟動炎癥反應的關鍵因子，導致血管內皮細胞損傷而引起的炎癥反應是促使動脈粥樣硬化發生發展的重要因素。IL－6是由活化的單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、內皮細胞及成纖維細胞等分泌的一種具有多種效能的細胞炎癥因子，可促進T淋巴細胞增殖、分化、生成，促進B淋巴細胞增殖、分化，產生抗體，參與炎癥過程［10］。其血清水平不僅可預測健康人群將來患心肌梗死的危險度，而且冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的預后也與之有關［11］。IL－1β 是一種激素樣蛋白質，為發現最早的細胞因子之一，是由活化的內皮細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞及單核巨噬細胞產生的，IL－1β是參與AS過程的一個重要因子，在AS斑塊中的泡沫細胞IL－1β含量豐富，外周血單核細胞在吞噬大量氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)后產生大量 IL－1β，IL－1β 一方面可激活單核－巨噬細胞、淋巴細胞產生多種細胞因子和生長因子，這些活性物質能改變血液動力學特性并促進動脈粥樣化的形成［12］。

體外試驗表明，損傷血管局部釋放的IL－6、TNF－α可刺激血管平滑肌細胞使活化MMP－9的表達增高。這可能打破MMPs活性在局部的平衡狀態，促進了血管基質的降解，從而有利于血管平滑肌細胞的移行。動物實驗也表明了MMP－9的過表達增強了血管平滑肌細胞的移行［11］，用MMPs抑制劑幾乎可完全抑制血管平滑肌細胞從中膜移行至內膜的數量。MMP－9基因消除鼠的體外研究頸動脈血管平滑肌細胞，與野生鼠的血管平滑肌細胞相比，也發現其移行活動降低［9］。

本研究表明，急性冠脈綜合征患者血清中TNF－α、IL－6、IL－1β 水平明顯增高，說明 TNF－α、IL－6、IL－1β在ACS的炎癥反應發生中起到了作用。患者血清中 MMP－9 水平與 TNF－α、IL－6、IL－1β 水平有明顯相關性，說明 MMP－9 水平與 TNF－α、IL－6、IL－1β 在ACS中共同發揮著作用。

［1］ Davies MJ.Reactive oxygen species，meta11oproteinases，and p1aque stabi1ity［J］.Circu1ation，1998，97(31):2382－2383.

［2］ Foda HD，George S，Ro11o E，et a1.Regu1ation of ge1atinases in human airway smooth musc1e ce11s:mechanism of proge1atinase A activation［J］.Am J Physio1，1999，277(2):174－182.

［3］ Kai H，Ikeda H，Yasukawa H，et a1.Peripheri1 b1ood 1eve1s of matrix meta11oproteinase 22 and 29 are e1evated in patients with acute coronary syndromes［J］.Am Co11 Cardia1，1998，32(4):368－372.

［4］ Rider PM，Rifai N，Stampfer MJ，et a1.P1asma concentration of inter1eukin－6 and the risk of future myocardia1 infarction among apparent1y hea1thy men［J］.Circu1ation，2000，101(29):1767－1772.

［5］ Luan Z，Chase AJ，Newby AC.Statins inhibit secretion of meta1－1oproteinases－1，2，3，and－9 from vascu1ar smooth musc1e ce11s and macrophages［J］.Atheriosc1er Thromb Vasc Bio1，2003，23(11):769－774.

［6］ Zhang B，Ye S，Herrmann SM，et a1.Functiona1 po1ymorphism in the regu1atory region of ge1atinase B gene in re1ation to severiry of coronary at herosc1erosis［J］.Circu1ation，1999，99(44):1788－1794.

［7］ B1ankenberg S，Poirier O，Bicke1 C，et a1.P1asma concent rations and genetic variation of matrix meta11oproteinase 29 and prognosis of patients with ardiovascu1ar disease［J］.Circu1ation，2003，107(12):5792－5851.

［8］ Morgan AR，Zhang B，Tapper W，et a1.Hap1otypic ana1ysis of the MMP－9 gene in re1ation to coronary artery disease［J］.J Mo1 Med，2003，81(5):321－326.

［9］ Desmet BJ，Dek1eijn D，Hanemaaijer R，et a1.Meta11oproteinase inhibition reduces constrictive arteria1 remode1ing after ba11oon angiop1asty:a study in the matherosc1erotic Yucatan micropig［J］.Circu1ation，2000，101(30):2962－2967.

［10］ Stemme S，Hanss on GK.I mmune mechanisms in ather ogenesis coron［J］.Ann Med，1994，26(3):141－146.

［11］ Leung T，Manser E，Tan L，et a1.A nove1 serine/threonine kinase binding the Ras 2 re1ated RhoA GTPase which trans1ocates the kinase to periphera1membranes［J］.J Bio1 Chem，1995，270(102):29051－29054.

［12］ Ozeren A，Aydin M，Tokac M，et a1.Leve1s of serum I－beta，IL－2，IL－8 and tumor necr osis factor 2 a1 pha in patientswith unstab1e angina［J］.Mediators Inf1amm，2003，12(5):361－365.