犬大腦中動脈近端栓塞建立類腔隙性腦梗死模型的研究

程期光 劉圣 許曉泉 祖慶泉 盛曄 余靜 施海彬

·實驗研究·

犬大腦中動脈近端栓塞建立類腔隙性腦梗死模型的研究

程期光 劉圣 許曉泉 祖慶泉 盛曄 余靜 施海彬

目的 研究介入法血栓栓塞犬大腦中動脈（MCA）建立腦梗死模型的可行性、穩定性及急性期在磁共振擴散加權成像（DWI）上的演變過程，并探討該模型的發生及其可能的發病機制。方法 成年健康畢格犬6只，插管至左側頸內動脈后采用1條直徑約1.7 mm、長5 mm的白色血栓栓塞，栓塞成功后30 min～6 h內每30 min使用DWI序列連續掃描觀察梗死病灶急性期的演變過程。栓塞后24 h、7天復查血管造影、MR掃描及神經功能評分，記錄梗死灶的出現時間、位置及大小，分別比較6 h DWI病灶、24 h和7天的T2加權像上病灶的體積，并比較24 h與7天的神經功能評分。7天后處死動物取腦組織行病理檢查。結果 所有犬皆為左側MCA的近端栓塞，DWI在栓塞后(1.24±0.51)h可以在基底節、腦白質區顯示單一或數個異常信號病灶，6 h DWI病灶的直徑為(6.90±2.08)mm。共有9個病灶在三個時間點都可以顯示，病灶的大小均＜10 mm； 栓塞后6 h DWI，24 h T2WI以及7 d T2WI病灶體積分別為(168.39±138.11)mm3、(186.88±161.54)mm3和(165.89±135.30)mm3，三者之間差異無明顯統計學意義（P=0.0531）。7 d時動物均存活，24 h和7 d的神經功能評分分別為4.50±1.38和2.33±0.82（P=0.0009）。病理學檢查證實為基底節梗死最常見，其次為腦白質區。結論 介入單栓子栓塞法可以成功建立犬MCA近端栓塞的類腔隙性腦梗死模型，DWI能夠在早期檢測到小的腦缺血病灶。犬擁有豐富的顱內外血管吻合，近端大血管栓塞可形成類腔隙性腦梗死的病灶，因此栓塞可能是腔隙性腦梗死的病因之一。

動物實驗； 血栓形成； 大腦中動脈； 腦梗死

腔隙性腦梗死約占所有腦缺血性發作性疾病的25%[1]。早期多認為顱內穿支動脈的病變（包括脂透明膜病、動脈粥樣硬化等）是造成深部腦組織腔隙性梗死的主要原因。近期有學者發現在豐富的顱內外血管吻合存在的情況下，顱內大血管栓塞也可僅形成腦組織深部的小面積梗死[2-4]，但其確切的發生機制尚存在爭議。

建立合適的實驗動物模型是研究和驗證疾病形成機制的重要手段，然而由于腔隙性腦梗死涉及顱內穿支動脈的特殊性，建立相應的模型相對困難；且常用的相關實驗動物也存在一些不足：目前多用鼠作為實驗動物，通過顯微外科結扎動脈或非血栓栓塞建立梗死模型，但實驗需要顯微外科手術，操作難度大；且鼠與人腦組織差異較大，無法較好地模擬人發病時的情況[5]。

為進一步探討腔隙性腦梗死的發病機制，本實驗采用與人腦組織結構相似的畢格犬作為研究對象，通過介入自體血栓栓塞犬大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）近端，實驗發現可以建立較穩定的類腔隙性腦梗死動物模型，同時利用DWI掃描動態監測腔隙性梗死灶的變化規律，為目前腔隙性腦梗死病因的理論假設提供了一定的實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物

成年畢格犬6條（本校實驗動物中心提供），雌雄不限，體重12～15 kg，3 ml/kg肌內注射戊巴比妥鈉麻醉，維持犬體溫在37～39℃左右。雙側股動脈、左側股靜脈穿刺置入5F導管鞘以監測血壓、血氣等指標及靜脈給藥。該實驗方案經過我校倫理委員會批準后進行。

二、血栓制備

抽取犬自體靜脈血10 ml，以4000 r/min離心10 min。取上層血漿約4.0 ml，加入1.0 ml含250 U凝血酶的生理鹽水中，混勻后立即注入8F截斷的導引導管中（內徑約2.5 mm，長約20 cm）。室溫下放置2 h后將凝固及水分析出的線樣血栓從導管中取出，置入生理鹽水中反復漂洗，再用吸水紗布吸干血栓表面水分，此時血栓直徑約為1.7 mm，然后將血栓剪成長為5 mm的血栓條備用。

三、模型建立

經右側股動脈鞘引入5F椎動脈導管，分別插管至雙側椎動脈、頸外動脈及頸內動脈行血管造影，后插管至左頸內動脈上升支內約2 cm處，手推對比劑并確認無明顯反流后，用裝有生理鹽水的10 ml注射器吸取1枚血栓注入導管，血栓注入后換裝有2 ml造影劑注射器緩慢推入，當大腦前動脈顯影時說明血栓進入了大腦中動脈（middle cerebral artery, MCA）并進行血管造影證實，栓塞后分別于6 h、24 h、7 d造影以觀察血管的再通情況。栓塞操作通常需耗時約20 min，模型建立后實驗動物立即被轉運至MR檢查室行MR掃描。

四、栓塞后評估

1.MR評估：MR掃描采用3.0T 磁共振掃描儀（Magnetom Trio，西門子），直徑15 cm的膝關節掃描線圈，于栓塞完成后30 min開始進行。掃描序列及參數包括：①T1加權成像參數：TR 1390 ms，TE 11 ms，包括22 層，2 mm 層厚，20 cm視野，矩陣320×320；②T2加權成像參數：TR 5000 ms，TE 66 ms，包括22層，2 mm 層厚，20 cm視野，矩陣320×320；③擴散加權成像（diffusion weighted imaging，DWI）參數：TR 5500 ms，TE 97.3 ms，2 mm層厚，22 cm視野，矩陣192×192，b值50及800 s/mm2。6 h以內間隔30 min重復掃描一次，栓塞后24 h及第7天時采用同樣參數復查。兩個獨立觀察者采用Image J軟件通過栓塞后6 h的DWI及栓塞后24 h、7 d的T2WI圖像測量犬腦梗死灶的體積。

本實驗結合文獻報道及犬的腦組織體積[5-6]將犬的腔隙性腦梗死定義為MR圖像包括DWI、T2WI及經TTC染色后的腦組織病理標本上位于基底節、腦干或腦白質區的圓形或卵圓形的缺血性病灶，最大直徑≤10 mm。

2.神經功能評分：本實驗神經功能評分采用國際上通行的犬的神經功能評分方法[7]。評分項目包括：①運動功能（無異常=1，輕偏癱但能行走=2，輔助下能站立=3，重偏癱不能站立、昏迷、死亡或無法測試=4）；②意識狀態（正常=1，輕度減弱=2，嚴重影響=3，昏迷或死亡=4）；③頭旋轉（無=0，強迫轉向病側或更加嚴重的狀態=1）；④轉圈（無=0，出現=1，無法運動或死亡=1）；⑤偏盲（無=0，出現或更加嚴重的狀態=1）。每條犬分別在麻醉前、栓塞后24 h及栓塞后第7天由兩位觀察者獨立評分并取平均值。

3.病理檢查：栓塞后第7天靜脈注射過量戊巴比妥（80 mg/kg）處死實驗動物，完整地取出腦組織置入冰水中固定10 min，后制成層厚約2 mm的冠狀切片，避光環境下置入濃度為2 %的TTC溶液（37℃）中染色30 min。將完成染色的切片置入4%甲醛液中固定72 h，HE染色后光鏡下觀察。

五、數據分析

結 果

一、血管造影

血管造影可以清晰顯示畢格犬的腦血管解剖結構。采用單血栓栓塞，每只犬的左側MCA近端主干均被成功栓塞，同側的頸內動脈、大腦前動脈以及大腦后動脈均能正常顯影。通過同側的大腦前動脈和大腦后動脈的皮質支與終末的軟腦膜之間的吻合，左側MCA遠端（皮質支）在栓塞后造影的動脈晚期也可顯影。栓塞后24 h，所有6只實驗犬的左側MCA均沒有出現血管再通。栓塞后7 d時復查血管造影發現閉塞的MCA部分或全部再通（圖1）。

圖1 畢格犬栓塞前后腦血管的DSA圖像 顱內造影示動脈顯影清晰，A.栓塞前造影所示左側MCA（箭）；B.栓塞后左側MCA近端未見顯示，動脈晚期同側遠端皮層動脈通過側支循環顯影；C.栓塞后7 d復查DSA證實血管基本再通

二、MR成像

栓塞后6 h內T2WI圖像均未觀察到異常信號變化，但DWI圖像上較早出現了高信號灶，且梗死發生時間越長，病灶信號強度越高，邊界越清晰（圖2）。大部分（4例）圖像僅出現單發病灶，均分布于左側尾狀核區域，1例（dog4）出現兩處病灶，分別位于左側尾狀核及左側內囊，1例（dog5）發現了4處高信號灶，分別位于左側尾狀核、內囊、丘腦旁白質及皮質，該皮質區病灶于栓塞后5.5 h才被觀察到，且栓塞后第7 d的MR掃描及大體標本上均未再次見到，因此本實驗中統計時將此數據剔除。這樣對術后6 h內DWI共檢測出的9處病灶進行了統計分析，平均檢出時間為(1.24±0.51)h，術后6 h DWI病灶直徑平均為(6.90±2.08) mm；栓塞后6 h DWI病灶的最大徑均＜10 mm，符合我們文中腔隙性梗死的定義。栓塞后6 h、24 h以及7 d三個時間點分別測得梗死灶體積為(168.39±138.11)mm3，(186.88±161.54) mm3及(165.89±135.30)mm3。7 d時梗死灶體積較24 h呈縮小趨勢，但三者體積間差異無統計學意義（P=0.0531，表1）。

圖2 連續的DWI和T2WI冠狀位掃描圖像 分別采自栓塞后1 h（A）、2 h（B）、6 h（C）、24 h（D）以及7 d（E）。栓塞后1 h左側基底節區DWI上觀察到高信號灶（A），隨著時間進行，DWI信號逐漸增高，栓塞后7 d病灶信號有減小、減低趨勢。6 h內T2WI均未檢出異常信號灶（A～C），24 h以及7 d可以觀察到相應區域T2WI高信號

表1 栓塞后MR成像評估及神經功能評分

三、神經功能評分

栓塞后24 h時動物蘇醒后進行神經功能評估：6條實驗犬中有5例表現出神經功能障礙，其中4例表現為右側肢體輕度偏癱，但能正常行走，另外1例表現為頸部向對側偏斜，1例僅在栓塞后24 h的DWI上示左側尾狀核出現孤立小病灶（直徑3.5 mm）的犬（dog2）未表現出任何可以觀察到的行為異常。栓塞7 d后所有動物均存活，動物的神經功能障礙也基本正常，6例中僅有1例殘留右側肢體輕偏癱及頸部向對側偏斜。術后24 h及7 d時平均神經功能評分分別為4.50±1.38和2.33±0.82，前者高于后者（t=7.0502，P=0.0009）。MR掃描數據及對應神經功能評分見表1。

四、病理結果

所有犬腦組織標本均未見明顯腦組織腫脹以及出血，并可在肉眼下于栓塞側深部腦實質觀察到梗死灶，多位于左側尾狀核，少數分布在內囊和腦白質，與MR掃描結果一致。梗死灶直徑約3～8 mm不等，中央呈灰白色（圖3A），光鏡下可見梗死區周圍腦組織輕度水腫，神經細胞發生凝固性壞死，細胞輪廓模糊，神經細胞和膠質細胞明顯減少甚至消失，部分區域見中性粒細胞浸潤，小膠質細胞增生吞噬，梗死灶和正常區之間有明顯的分界，由內向外分別為梗死區、水腫帶及正常區（圖3B）。

圖3 左側基底節區梗死灶冠狀位腦組織標本及病理 A.TTC染色后左側基底節區見直徑約4.5 mm大小未染區域；B.光鏡下見梗死區與正常區之間分界明顯，神經細胞數目明顯減少，凝固性壞死及核裂解（HE，×100）

討 論

本研究通過介入插管及血栓栓塞的方法成功建立了犬MCA近端栓塞的腦梗死動物模型，該模型的制作具有操作簡便、動物的選擇及發病與人類更加相似、創傷小而動物易存活等優點，并且第一次對類腔隙性腦梗死的小病灶在MR上的演變過程進行了研究。實驗結果證實在腦側支循環豐富的動物其近端大血管栓塞可以造成近似于人類腔隙性腦梗死的病灶，由此我們推測在人類存在MCA等大血管狹窄并建立了相對豐富的顱內外側枝循環的基礎上，其血管的近端栓塞可能會僅造成腔隙性腦梗死表現。該動物模型不僅能夠為臨床現象提供一定的實驗性證據，而且可能為臨床上針對腔隙性腦梗死的個體化治療甚至溶栓治療提供依據，從而改善其預后和提高療效[1-4,8]。

因為容易獲得，價格經濟，與人體解剖結構相近及腦血管變異小等優點，本研究選擇了畢格犬作為實驗動物建立腦梗死模型。但是由于畢格犬的頸內動脈扭曲而難以進行選擇性插管，加上其頸內外動脈之間側支循環相對豐富以及血栓偶有碎裂等原因，建立穩定的梗死模型是本實驗的難點。我們在預實驗中發現畢格犬MCA的M1段長度約13 mm，直徑約1.0 mm，且有文獻指出長約5 mm，直徑約1.66 mm的栓子較易進入到MCA[9-10]，因此該研究制作的自體白色血栓長為5 mm，直徑1.7 mm。這種改良后的栓子穩定，彈性好，易于注射，而且實驗中證實經頸內動脈注射時全部栓塞近端MCA的同時不影響周圍的動脈。我們分析認為可能主要是因為①MCA是頸內動脈的延續，血栓注入時會自然進入該血管；②犬大腦前動脈的管徑相對較小，選擇較大直徑的血栓無法進入其開口[10]。本研究結果顯示大多數犬的梗死灶出現于尾狀核區域，分析原因可能是這些區域主要由豆紋動脈等深部穿支動脈等供血，這些動脈大多從MCA近端發出，注入的血栓阻擋了腦深部穿支動脈的開口，導致的局部梗死灶的形成。而MCA遠端由于建立末梢側支循環而血流不受明顯影響，因此并未出現梗死灶。6只犬中有4只犬腦組織內僅出現單發病灶，2只犬出現多發梗死灶，分析可能與深部穿支動脈的位置與數目變異相關[5,11]。

近年來，功能性影像學檢查如CT灌注成像、DWI、灌注加權成像（perfusion weighted imaging，PWI）等特殊成像方法在腦梗死的早期診斷和治療過程中發揮了巨大的作用[12-14]。既往文獻報道DWI在腦梗死發病數分鐘內就可以顯示出信號異常，也有研究認為DWI顯示病灶的時間與病灶的大小、部位等因素相關[4,13]。但因為腔隙性腦梗死的臨床癥狀相對輕，甚至大部分患者表現為隱匿性梗死從而在臨床上被忽視，因此臨床上對這種小病灶急性期DWI圖像特點及其演變過程的經驗仍不足。本實驗中在栓塞后30 min開始進行DWI掃描，多數病灶平均1 h左右可以被檢出，經分析梗死灶的大小與檢出時間并無明確的統計學相關性。在6 h時（超急性期）所有犬DWI圖像上都可以明確病灶的大小和部位，因此初次測量梗死體積時采用的是6 h時DWI圖像。24 h及7 d的T2WI圖像上所顯示的梗死灶的位置與6 h的DWI圖像相一致。本實驗中24 h較6 h梗死體積有增大趨勢，有研究證明急性梗死灶在急性期隨著時間進行性增大，約于70 h達到最大值，考慮由于異常灌注影響梗死周圍缺血組織不斷地向梗死方向發展從而導致梗死體積增大，同時梗死局部組織急性期水腫也是影響體積變化的因素；梗死體積穩定后隨時間進行逐漸縮小，分析可能和血管部分再通以及側支循環建立促進水腫、壞死組織的吸收有關[6,8,15]，印證了本研究中7d時梗死灶的范圍相對于前面的時間點呈現出縮小的趨勢，這與神經功能評分的結果也相一致。

本研究也存在一些不足之處，首先在于實驗動物數量相對較少，并且沒有進行長期的隨訪研究；另外，為精確地研究DWI的動態變化過程，本研究的MR掃描時間間隔為30 min，沒有能夠進行PWI檢查并探討DWI與PWI的匹配情況等，這些都需要今后的實驗中進一步完善。

總之，本研究通過自體血栓及血管介入栓塞等技術，栓塞畢格犬的MCA近端建立了類似于人類腔隙性腦梗死的動物模型，并由此推測血栓栓塞可能是腔隙性腦梗死的病因之一。DWI掃描可以在發病早期檢測病灶，在一定范圍內病灶大小與顯示時間沒有明確的相關性，隨著時間的延長病變的顯示更加清晰，DWI信號異常的部位、大小與最后的梗死灶有很好的匹配性。

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Canine embolic stroke model resembling lacunar infarction following proximal cerebral artery occlusion

Cheng Qiguang, Liu Sheng, Xu Xiaoquan, Zu Qingquan, Sheng Ye, Yu Jing, Shi Haibin. Radiology Department, the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

Liu Sheng, Email: liusheng1137@sina.com

Objective To evaluate the feasibility, stability and process on diffusion weighted imaging (DWI) in acute phase of a middle cerebral artery (MCA) embolic occlusion stroke model in beagle dogs, and to discuss the potential mechanisms of lacunar infarction. Methods Six adult beagle dogs were involved in this study. After the catheterization was manipulated into the left internal carotid artery, an autologous clot about 1.7 mm in diameter and 5 mm long was injected through the catheter in each dog. The DWI was performed to evaluate the progression of ischemic lesions at 30 min interval within 6 h after embolization. The MR examinations with the same parameters and neurobehavioral scoring were performed at 24 h and 7 days after procedure. These animals were sacrifced for pathological examination at 7 days after embolization. Results The left proximal MCA ware successfully occluded in all dogs using single-thrombus method. The solitary or multiple ischemic lesions shown as high signal intensity on DWI were observed with the mean detecting time of (1.22±0.51)h in the deep brain area, and the mean diameter of induced infarctions was (6.90±2.08)mm on 6 h-DWI after embolization. The mean volume of these lesions was (168.39±138.11)mm3, (186.88±161.54)mm3 and (165.89±135.30)mm3 at 6 h on DWI, 24 h and 7 days on T2 image, respectively. The statistical analysis didn’t show significant difference in the volume among the three time points (P=0.0531). The neuro-behavioral scores were 4.50±1.38 at 24 h and 2.33±0.82 at 7 days after procedure (P=0.0009). The ischemic infarctions located in the basilar ganglion area were most frequent in pathological examination. Conclusions The DWI abnormalities resembling lacunar infarcts can be detected in early phase after reliable proximalMCA occlusion using thrombi in beagle dogs, which exist abundant collateral anastomosis between the ECA and ICA. Our results provide further support for the concept that emboli may be a potential cause of lacunar infarcts.

Animal experimentation； Thrombosis； Middle cerebral artery； Cerebral infarction

2014-8-14）

（本文編輯：黃強）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2015.01.009

210029 南京醫科大學第一附屬醫院放射科（程期光、劉圣、許曉泉、祖慶泉、盛曄、余靜、施海彬）

劉圣，Email：liusheng1137@sina.com