外周血結核T細胞檢測在肺結核涂陰患者中的臨床研究

黃其俊 宋大偉 吳堅敏 汪強

[摘要] 目的 探討外周血結核T細胞檢測在肺結核涂陰患者診斷中的臨床價值。 方法 將研究對象分為兩組：肺結核組96例，其中涂陰肺結核71例，其他肺部疾病組60例。所有患者分別進行外周血結核T細胞的γ-干擾素釋放試驗（TB-IGRA）、血清結核抗體和結核菌素試驗（PPD試驗）。 結果TB-IGRA試驗、結核抗體和PPD試驗在涂陰肺結核組與其他肺部疾病組陽性率比較，差異有統計學意義（P均<0.01）；TB-IGRA試驗在肺結核涂陰組與涂陽組中定性與定量結果比較，差異無統計學意義（P均>0.05），其在涂陰肺結核診斷中敏感性和特異性分別是90.1%和91.7%，陽性預測值、陰性預測值分別是92.8%和88.7%，與結核抗體和PPD試驗比較，差異有統計學意義（P<0.01）。 結論 外周血結核T細胞檢測在涂陰肺結核的診斷上具有敏感性和特異性高、結果客觀等優點，有助于對涂陰肺結核的患者進行鑒別診斷，以避免誤診誤治。

[關鍵詞] 痰涂片；肺結核；診斷；外周血結核感染T細胞

[中圖分類號] R521 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）28-0099-04

結核病是嚴重危害人們健康的呼吸道傳染病，我國結核病發病人數居世界第二位[1]。快速準確地檢測結核分枝桿菌的感染是控制結核病流行的關鍵[2]。細菌學檢查是診斷肺結核的金標準，但是肺結核涂陰患者的診斷在臨床上常由于痰涂片檢測陰性、痰培養方法檢測周期長和敏感性低等問題，給臨床診斷帶來一定的困難。影像學、結核菌素試驗、結核抗體和分子診斷技術均存在一定的局限性[3]，因此尋求新方法對肺結核進行早期診斷具有重要的臨床意義。結核分枝桿菌是結核病的主要致病原，屬于胞內感染菌，誘發反應是以T細胞為主的細胞免疫[4]。近年來，建立在以T細胞為基礎的結核分枝桿菌特異性γ-干擾素釋放試驗目前已列入歐美等國家結核病診療指南，以協助診斷結核感染的存在[5，6]。本試驗主要探討外周血結核T細胞檢測在肺結核涂陰患者診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2013年7月～2015年3月在我院感染科或呼吸科診治的患者。入選標準：①患者有咳痰、咳嗽等呼吸道癥狀，CT檢查或X片顯示肺部有陰影；②年齡18～60歲，性別不限。排除標準：①妊娠；②SLE、風濕等自身免疫性疾病；③艾滋病；④器官移植、使用免疫抑制劑等患者。肺結核診斷主要依據痰涂片檢查、影像學資料和臨床癥狀并參照肺結核的診斷標準排除其他疾病后確診[7]。涂陰肺結核的診斷符合中華結核病診治指南。其他肺部疾病患者通過血常規、痰培養、胸片等檢查確診或抗炎治療排除肺結核者，如肺炎、肺部腫瘤、支氣管擴張等。將入選患者分為兩組：肺結核組96例（含涂陽25例和涂陰71例），其中男59例，女37例，平均年齡（45.2±13.1）歲；其他肺部疾病組60例，包括肺炎34例，肺氣腫9例，肺癌11例，慢性阻塞性肺疾病6例，其中男37例，女23例，平均年齡（46.9±14.5）歲。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

入選患者分別檢查痰涂片（抗酸染色）、外周血結核T細胞檢測、結核抗體（膠體金法）和PPD試驗。

1.2.1 外周血結核T細胞檢測 體外釋放酶聯免疫法，北京萬泰生物公司試劑盒。（1）IFN-γ的體外釋放：①在2 h內將全血標本輕柔顛倒混勻3～5次后分裝到N（本底對照）、T（測試）、P（陽性對照）三種培養管中，1 mL/管。②培養：將培養管輕柔顛倒混勻5次后迅速置入37℃培養（22±2）h，培養過程中須保持培養管直立。③離心：培養后的培養管以（3000～5000） r/min離心10 min，取血漿進行ELISA檢測，注意不可吸到細胞層。（2）IFN-γ的定量檢測：采用ELISA法，以校準品（12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL）的抗原含量及其對應的吸光度均值制得標準曲線，求出線性回歸方程，將N、T、P三種培養管培養后血漿標本的吸光度值分別代入回歸方程，求得三種管中血漿標本相應的IFN-γ含量。（3）IFN-γ的陽性判定：按照試劑盒說明書進行，以T管與N管含量差值即（T-N）≥14，并且≥N/4，結果判定為陽性[8]。

1.2.2 結核菌素試驗 采用成都生物制品研究所生產的試劑（BCG-PPD，50 IU/mL）。①以PPD試劑0.1 mL（5IU）于左前臂內側中上1/3處皮內注射，使局部形成皮丘。②經72 h后觀察注射部位硬結平均直徑[（橫徑+縱徑）/2）]。硬結<5 mm為陰性，5～9 mm為弱陽性，10～19 mm為陽性反應，提示結核桿菌感染，≥20 mm（或<20 mm但有水皰或壞死時）為強陽性[9]。本研究以硬結直徑≥10 mm時，結果判定為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TB-IGRA試驗、結核抗體和PPD試驗對涂陰肺結核診斷的評價指標分析

由公式：靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）可知，在涂陰肺結核組中TB-IGRA試驗敏感性為90.1%[64/（64+7）]，與血清結核抗體和PPD試驗的敏感性相比，差異均有統計學意義（χ2=16.7、8.7，P<0.01）。TB-IGRA試驗在涂陰肺結核組的敏感性遠遠高于在其他肺部疾病組中的敏感性（χ2=87.3，P<0.01）。由公式：特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）可知：TB-IGRA試驗在涂陰肺結核診斷中的特異性為91.7%[55/（55+5）]，明顯高于結核抗體（73.3%）和PPD試驗（68.3%），差異有統計學意義（χ2=7.0、10.2，P<0.01）。見表1。TB-IGRA試驗對涂陰肺結核診斷的陽性預測值為92.8%，與血清結核抗體、PPD試驗相比，差異均有統計學意義（χ2=9.9、9.2，P<0.01）。TB-IGRA試驗對涂陰肺結核診斷的陰性預測值為88.7%，與血清結核抗體和PPD試驗相比，差異有統計學意義（χ2=13.1、9.0，P<0.01）。

表1 TB-IGRA試驗、結核抗體和PPD試驗對涂陰肺結核診斷的評價指標比較

2.2 肺結核患者涂陰、涂陽組TB-IGRA試驗定性與定量結果比較

TB-IGRA試驗在肺結核涂陰、涂陽兩組中的敏感性比較，差異無統計學意義（χ2=0.075，P>0.05），兩組中的定量結果比較也無顯著性差異（t=0.59，P>0.05），見表2。

表2 肺結核患者涂陰、涂陽組TB-IGRA試驗定性與定量結果比較

3 討論

肺結核是一種常見且難以進行病原學診斷的疾病，防治形勢不容樂觀[10]。對于肺結核患者進行早期診斷和治療是控制結核病播散的重要環節，也是改善患者預后的關鍵。痰涂片抗酸染色比培養快，能在早期為呼吸道感染的診斷和治療提供重要信息，但無法區分死活菌及非結核分枝桿菌，受制于痰液中分枝桿菌的數量，故敏感性較低[11]，本研究陽性率僅為26.0%（25/96），使漏檢人數顯著增加。肺結核常表現為午后低熱、納差、乏力、盜汗、消瘦等，呼吸道方面有咯血、咳痰、咳嗽、呼吸困難和不同程度胸悶、胸痛等癥狀。目前，診斷痰菌涂陰的肺結核患者主要依靠典型的臨床癥狀、PPD試驗或經纖維支氣管鏡的肺組織活檢、肺部影像檢查的特征性改變等，但臨床上仍有部分患者缺乏典型的臨床癥狀和肺部影像學改變、PPD試驗呈陰性或弱陽性、不愿接受纖支鏡檢查或病情重不能耐受者，因此給涂陰肺結核的診斷帶來困擾。

我國臨床實驗室開展的結核病相關檢查有皮膚結核菌素試驗、血清結核抗體、痰涂片找抗酸桿菌和結核桿菌培養等，這些方法在診斷敏感性和特異性等方面均存在一些不足。結核菌素試驗是基于Ⅳ型變態反應的一種皮膚試驗，用來檢測機體有無感染過結核桿菌，凡感染過結核桿菌的機體，會產生相應的致敏淋巴細胞，具有對結核桿菌的識別能力，當再次遇到少量的結核桿菌或結核菌素時，致敏T淋巴細胞受相同抗原再次刺激會釋放出多種可溶性淋巴因子，導致血管通透性增加，巨噬細胞在局部集聚，導致浸潤，約在48～72 h內，局部出現紅腫硬結的陽性反應，若受試者未感染過結核桿菌，則注射局部無變態反應發生[12]，但該試驗容易受到交叉反應、機體免疫力狀況等影響[13]，PPD試驗陰性還可見于以下情況：結核菌感染后需4～8周有變態反應充分建立，在變態反應前期，PPD試驗常陰性；嚴重結核病和各種危重患者對結核菌素無反應或弱陽性，是由于人體免疫力連同變態反應暫時受到抑制的結果；其他如淋巴細胞免疫系統缺陷（如白血病、淋巴瘤、艾滋病等）患者和老年人的結核菌素反應也常為陰性。硬結直徑為5～9 mm不能排除因接種卡介苗所致，本研究即使以硬結直徑10 mm作為診斷臨界值，特異性僅為68.3%。血清結核抗體檢測也會因接種卡介苗或其他分枝桿菌感染等影響而出現假陽性，而在免疫力低下患者，不能產生足量的結核抗體導致假陰性結果[14]。外周血結核T細胞的γ-干擾素釋放試驗是結核病診斷領域的重要進展，建立在以T細胞為基礎的體外IFN-γ測定方法，從而評估患者的T淋巴細胞是否被結核分枝桿菌特異性抗原致敏。本試驗試劑盒采用體外釋放酶聯免疫法原理衡量特異性抗原介導的細胞免疫反應強度。主要使用兩種特異性抗原，分別是ESAT-6（早期分泌抗原-6）和CFP-10（培養濾出液蛋白-10），刺激結核分枝桿菌感染者特異性T淋巴細胞并使其增殖，釋放γ-干擾素。微孔條上預包被的IFN-γ抗體可與標本中的IFN-γ結合，再加入酶標試劑進行二次混育。當標本中存在IFN-γ時，將形成“包被抗體-IFN-γ-酶標抗體”復合物，然后進行ELISA顯色，通過酶標儀檢測吸光度，計算標本中的IFN-γ含量，從而判斷該患者是否具有針對結核分枝桿菌特異性的T細胞免疫反應，可用于結核分枝桿菌潛伏感染或活動感染的輔助診斷。本試劑盒采用的致病性結核分枝桿菌有卡介苗、其他分枝桿菌沒有的缺失區域1（RD1）中兩種基因的重組抗原[15，16]，因此其結果不受卡介苗接種和非結核分枝桿菌的影響，國內相關研究結果顯示該試驗對結核感染有較高的診斷價值[17-20]。由表1可知，TB-IGRA試驗對于涂陰肺結核診斷的敏感性（90.1%）、特異性（91.7%）均較高，陽性預測值為92.8%，陰性預測值為88.7%，與其他肺部疾病組相比存在顯著性差異，與同組的PPD試驗、血清結核抗體相比也存在顯著性差異。同時發現TB-IGRA試驗在肺結核涂陽、涂陰兩組中靈敏度無顯著性差異，因此在指導涂陰結核的診斷方面具有重要的臨床意義。

綜上所述，肺結核痰涂片菌陰性患者臨床診斷有時較為困難，皮膚PPD試驗和血清結核抗體因其較高的假陽性、假陰性，常可能造成臨床的誤診和漏診。外周血結核T細胞檢測作為一種新的早期診斷結核感染的免疫學方法，對涂陰患者顯示出非常高的敏感性和特異性，實驗室檢測操作簡便，不需要特別儀器，IFN-γ含量結果客觀，也不受確診前的預防性和經驗性等抗結核治療的影響，對臨床癥狀不典型、PPD試驗診斷不明確、涂陰肺結核具有重要的臨床價值。

[參考文獻]

[1] 全國第五以結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五以結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[R]. 中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

[2] 唐神結，肖和平. 結核病流行趨勢及治療未來展望[J]. 中國實用內科雜志，2012，32（8）：565.

[3] 袁麗娜，黨霞，史慧敏，等. 不同檢測方法對結核病的診斷價值[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2011，46（6）：945.

[4] Tsujimura K，Koide Y. T cell-mediated immune responses and the recognition of tuberculosis antigens[J]. Kekkaku，2010，85（6）：509.

[5] Denkinger CM，Dheda K，Pai M. Guidelines on interferon-γ release assays for tuberculosis infection：Concordance，discordance or confusion[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（6）：806-814.

[6] Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：New tools to tackle an old enemy[J]. Chest，2007， 131（6）：1898-1906.

[7] 中華醫學會. 臨床診療指南-結核病分冊[M]. 北京：人民衛生出版社，2005：64-86.

[8] 胡勇，楊唐斌. 兩種結核感染T細胞檢測試驗比較[J]. 中國實驗診斷學，2014，18（12）：2058.

[9] 楊紹基，任紅. 傳染病學[M]. 北京：人民衛生出版社，2012：214.

[10] World Health Organization，Global Tuberculosis Report 2014[M]. Geneva：World Health Organization，2014：282.

[11] 陸再英，鐘南山. 內科學[M]. 北京：人民衛生出版社，2012：48.

[12] 王蘭蘭，許化溪. 臨床免疫學檢驗[M]. 北京：人民衛生出版社，2012：271-272.

[13] 榮蘭香，馬淑紅，艾清，等. T.SPOT-TB試驗與PPD試驗對結核病患者診斷價值相關性比較[J]. 中國實驗診斷學，2013，17（8）：1476.

[14] Steingart KR，Flores LL，Dendukuri N，et al. Commercial serological tests for the diagnosis of active pulmonary and extrapulmonary tuberculosis：An updated systematic review and meta-analysis[J]. PLo S Med，2011，8（8）：e1001062.

[15] 劉旭暉，肖和平. γ-干擾素釋放試驗（IGRA）對于診斷結核分枝桿菌感染的應用[J]. 臨床肺科雜志，2009，14（5）：672-674.

[16] Dr Madhukar Pai，Lee W Riley，et al. Interferon-γ assays in the immunodiagnosis of tuberculosis：A systematic review[J]. The Lancet Infectious Diseases，2004，4（12）：761-776.

[17] 李曉非，李明武，蘇俊華. 體外γ-干擾素檢測結核分枝桿菌不同方法的應用價值比較[J]. 中華醫學感染學雜志，2012，22（13）：2952.

[18] 高孟秋，劉菲，紀濱英，等. 兩種γ-干擾素釋放分析在結核病臨床診斷中的比較研究[J]. 中華結核和呼吸雜志，2012，35（10）：762-765.

[19] 鄭建洲，王亞楠，俞小衛. 兩種γ-干擾素釋放試驗診斷結核病的性能比較[J]. 臨床檢驗雜志，2013，31（7）：556-557.

[20] 章旭夢，周華，符一騏，等. γ-干擾素釋放試驗在活動性結核病診斷中的臨床價值[J]. 臨床結核與呼吸雜志，2014，37（5）：372-373.

（收稿日期：2015-05-26）