孕馬尿中主要結合雌激素的TLC定性鑒別

2015-07-13 05:19:40姚軍任麗君李敏等

安徽農業科學 2015年7期

姚軍　任麗君　李敏等

摘要為了建立薄層色譜法快速評價新疆孕馬尿中結合雌激素品質的方法，將孕馬尿樣品采用大孔吸附樹脂固相萃取進行前處理，薄層板為硅膠G板（20×10 cm），展開劑為乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（30∶90∶22，體積比），顯色劑為20%的硫酸乙醇溶液。孕馬尿中3種主要結合雌激素在薄層板上呈現藍綠色斑點，尿中其他雜質無干擾。建立的薄層色譜法能夠對孕馬尿中主要結合雌激素快速鑒別，可用于孕馬尿結合雌激素品質評價。

關鍵詞結合雌激素；孕馬尿；薄層色譜法；質量控制

中圖分類號S857.2+2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-147-03

女性進入更年期，激素分泌急劇減少甚至不再分泌，激素的減少將嚴重影響婦女生理及心理健康。如果不予以重視和治療，將會大大增加更年期癥狀。雌激素補充療法作為治療婦女更年期綜合征的方法之一，在預防絕經后骨質疏松[1]、冠心病[2]及阿爾茲海默癥[3]方面起著非常重要的作用。懷孕母馬的尿液中富含雌激素，每匹孕馬在孕期內可形成雌激素50～ 100 g[4]。這些雌激素是一類結構較為相似的甾體化合物，在馬尿中它們多以硫酸鈉鹽形式結合，因此稱為結合雌激素（Conjugated estrogens，CE）。其中，雌酮硫酸鈉（Sodium estrone sulfate，ES）、馬烯雌酮硫酸鈉（Sodium equilin sulfate，EqS）及17α雙氫馬烯雌酮硫酸鈉（Sodium 17α-dihydroequilin sulfate， 17α-EqS）是其中最主要的成分，占孕馬結合雌激素總含量的90%以上，成為孕馬結合雌激素指標性成分。惠氏公司從20世紀40年代就開始從孕馬尿中提取結合雌激素，作為更年期婦女雌激素補充療法的藥物，結合雌激素一直作為婦女雌激素補充療法的主要藥物。

新疆地區具有極其豐富的牧業資源，其中伊犁河谷是目前世界上馬匹最集中的地區之一，不僅數量多，而且伊犁馬的優良品質揚名海內外。根據《新疆統計年鑒（2011）》有關數據[5]可知，截止2010年年底新疆馬匹存欄量為85.29萬匹，其中伊犁哈薩克自治州為新疆馬匹的集中分布區，其馬匹存欄量為56.04萬匹，占新疆馬匹存欄總量的65.71%。目前，已有不少制藥企業從孕馬尿中提取結合雌激素研發新的雌激素藥物，但由于孕馬資源屬于當地牧戶，在收購馬尿時需要對孕馬尿品質進行評價，因此建立簡便易行的檢測方法就顯得至關重要。目前，已經建立了銀化硅膠板分離孕馬結合雌激素的方法，但是由于銀化硅膠板中的銀離子極易氧化，實際操作中仍存在諸多問題，難以實際應用[6]。筆者建立了孕馬尿3種主要CE的TLC快速定性方法，可用于孕馬尿中結合雌激素品質的快速定性檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

儀器。薄層色譜儀（包括CAMAG LINOMAT5自動點樣器、CAMAG REPROSTAR3成像系統、CAMAG ADC2自動展開系統，瑞士卡瑪公司）；AB135-S電子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；高速冷凍離心機（HERAEUS MULTIFUGE X3R，美國Thermo scientific公司）；恒溫真空干燥箱（型號DZF-6090，購自上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.2

試劑。ES、EqS及17α-EqS對照品（新疆新姿源生物制藥公司提供，含量≥99.0%）；薄層色譜法所用甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸均為分析純；HPD-400大孔樹脂（上海摩速公司）；硅膠G板（20×10 cm）（青島海洋公司）。

1.1.3

試驗材料。

采集的孕馬尿樣品均來自新疆伊犁州新源縣土爾根鄉牧戶，批號分別為201301、201302、201303、201304、201305、201306、201307、201308、201309，以上9批為懷孕母馬尿液；批號分別為201310、201311、201312、201313為未懷孕母馬尿液。

1.2方法

1.2.1

3種CE對照品溶液的制備。精確稱取ES、EqS和17α-EqS對照品各20.0、10.0和7.5 mg，分別置于100 ml的容量瓶中，加入甲醇-水（50∶50）溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成ES、EqS、17α-EqS的濃度分別為200、100和75 μg/ml的儲備液。分別精密量取上述3種對照品儲備液2.0 ml置于10 ml容量瓶中，以甲醇-水（50∶50）溶劑定容，得到3種CE濃度分別40、20和15 μg/ml混合對照品溶液。

1.2.2

顯色劑溶液的配制。量取200 ml濃硫酸溶液，溶于乙醇中，最終定容至1 L，搖勻后得到濃度約為20%的硫酸乙醇溶液。

1.2.3

孕馬尿樣品的處理。

1.2.3.1

稀釋直接點樣。取馬尿10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋5倍，點樣。

1.2.3.2

液液萃取處理。取馬尿10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取上清液5 ml，加入0.5 g NaCl固體，分別加入10 ml和15 ml乙酸乙酯萃取2次，每次渦旋5 min合并乙酸乙酯層，搖勻，點樣。

1.2.3.3

固相萃取前處理。5 ml注射器管，用一篩板置于出口處，取HPD-400大孔吸附樹脂1.0 g，干法裝填，裝填體積約2 ml。

活化方法：先用5 ml無水乙醇活化，然后用5 ml純水在重力作用下洗脫。

取孕馬尿5 ml于高速離心機5 000 r/min離心5 min，準確量取上清液1.0 ml，緩慢滴入固相萃取小柱中，用5%NaCl溶液4 ml清洗，再用1.5%NaOH溶液4 ml清洗，棄去清洗液，再用無水乙醇洗脫并收集流出液至5 ml，搖勻，作為薄層色譜方法供試品，清洗和洗脫步驟均在重力作用洗脫。

1.2.3.4

薄層色譜條件。

薄層板：硅膠G板（20×10 cm）；展開劑：乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（體積比30∶90∶22）；點樣量為20 μl，點樣寬度3 mm；展開方式：利用自動展開系統，3次增量展開（即展開至硅膠板的1/3、2/3處時取出涼風吹干，放入缸中繼續展開）；顯色方式：浸入法顯色；于105 ℃加熱5 min后置于成像系統中紫外燈365 nm處檢視。

2結果與分析

2.1 樣品前處理方法的考察

分別進行了稀釋直接點樣、液液萃取、固相萃取3種前處理方法的考察，3種方法處理的樣品的TLC圖譜見圖1～3。