間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調(diào)控作用研究進展

趙培慶 王連慶 李濤

[摘要] 間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新與定向分化的干細胞，在組織修復與細胞生長發(fā)育中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細胞的發(fā)育過程中，部分長鏈非編碼RNA表達上調(diào)與下調(diào)，表明它可能是間充質(zhì)干細胞發(fā)育中的重要調(diào)控點，雖然目前該方面的功能性研究比較少，但其強大的研究潛力已經(jīng)體現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細胞；成骨分化；長鏈非編碼RNA

[中圖分類號] R34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（c）-0035-04

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新與定向分化能力的細胞，1966首次發(fā)現(xiàn)時被冠以“成纖維祖細胞”之名，目前已經(jīng)證實它可以分化成骨骼、軟骨組織、脂肪組織及肌肉等組織，并且在組織修復及細胞生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過分泌前列腺素E2（PGE2）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1RA）、白細胞介素-7（IL-7）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-11（IL-11）等細胞因子及生長因子來影響免疫微環(huán)境，對損傷的組織進行修復[3]。不同于胚胎干細胞，MSCs屬于成體干細胞，因此不具有無限自我更新和永生化能力[4]。基于以上理論基礎(chǔ)，因此其修復調(diào)控機制顯得尤為重要。

1 lncRNAs的概念及在干細胞發(fā)育分化中的作用

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄長度大于200 bp的非編碼RNA，有的甚至超過10 kb，可以形成復雜的空間結(jié)構(gòu)，表明它們參與基因表達調(diào)控的分子機制可能更加復雜。根據(jù)它們在基因組中的位置可以分為lincRNA、天然反義鏈lncRNA和內(nèi)含子區(qū)lncRNA[5]。目前已經(jīng)證實它們在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾水平進行調(diào)控，對基因表達調(diào)控、腫瘤診斷及闡述其分子機制方面越來越受到人們的重視。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在干細胞多能性及分化等方面起關(guān)鍵調(diào)控作用，Guttman等[6]通過轉(zhuǎn)錄測繪技術(shù)與染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)共發(fā)現(xiàn)40條與多能干細胞功能相關(guān)的lncRNAs，其中有20余條與多能標志物轉(zhuǎn)錄因子（Nanog，oct4）基因表達相關(guān)，表明其在胚胎干細胞分化過程中起重要調(diào)控作用。同時，Chakraborty等[7]也鑒定出3條與維持多能干細胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌細胞發(fā)育分化過程中，Wamstad等[8]也發(fā)現(xiàn)一條在其發(fā)育中起重要表觀遺傳調(diào)控作用的lncRNA。以上研究結(jié)果顯示，lncRNAs在干細胞的生長發(fā)育及分化過程中起重要調(diào)控作用，研究其調(diào)控過程及發(fā)現(xiàn)新的長鏈非編碼RNA勢必為干細胞相關(guān)研究找到新的途徑和方法。

2 間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中可能的最新調(diào)控策略

MSCs作為骨髓成骨細胞前體的重要來源，其分化增殖的時空特異性受到嚴格的調(diào)控。一般情況下，骨髓MSCs受遺傳和表觀遺傳機制調(diào)控，但具體的分子機制有待闡明，MSCs向成骨細胞分化主要涉及以下幾種信號傳導通路：TGF6信號通路、MAPK通路、Runx/osteorix信號通路、Notch通路、Wnt通路等[9]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通過抑制通路中Runx2蛋白等關(guān)鍵分子的表達對MSCs向成骨分化起抑制作用[10-11]；相反，miR-2861、miR-148b等[12-13]可通過激活成骨通路中關(guān)鍵分子，對成骨作用起正向調(diào)控。這些MSCs成骨調(diào)控因子構(gòu)成一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，對其成骨過程進行精細調(diào)節(jié)。已有研究證實lncRNAs可作為一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他RNA轉(zhuǎn)錄本競爭相同的microRNA，從而抑制microRNA對其靶基因的調(diào)控，但其在MSCs成骨作用中調(diào)控microRNA的具體機制目前還未見報道。Ye等[14]發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通過消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾對MSCs成骨分化進行調(diào)控，表明通過表觀遺傳學機制，KDM4B和KDM6B可作為治療靶點來控制MSCs分化過程，可為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病治療找到新的線索。近期，研究發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化生長因子β途徑抑制劑（small molecular SB431542）可快速誘導胚胎干細胞產(chǎn)生MSCs[15]，這一發(fā)現(xiàn)表明MSCs可通過大量生產(chǎn)應用于臨床治療與修復，但其中的具體調(diào)控分子機制目前還不是十分明確。體內(nèi)炎癥微環(huán)境對MSCs的調(diào)節(jié)也非常重要，微環(huán)境中的免疫細胞和炎癥因子可以活化MSCs，誘導其免疫調(diào)節(jié)功能。最近Dang等[16]學者發(fā)現(xiàn)炎癥因子誘導的自噬可以對MSCs免疫功能產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)使MSCs的臨床治療產(chǎn)生新的期望。總之，闡明MSCs的調(diào)控機制可對臨床治療及其成骨分化調(diào)控產(chǎn)生重大影響，lncRNAs作為近期發(fā)現(xiàn)的基因“富礦”，雖然在調(diào)控MSCs方面報道較少，但它應該在其細胞分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

3 lncRNAs對間充質(zhì)干細胞的調(diào)控作用

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的普及，lncRNAs的重要功能逐漸受到重視，lncRNAs可通過影響基因表達、表觀遺傳學修飾、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)等方式對生命活動進行調(diào)控。

在MSCs向軟骨分化過程中，Wang等[17]發(fā)現(xiàn)有3638個lncRNAs有較大程度的變化（2166個表達上調(diào)及1472個下調(diào)），作者選擇了兩個表達上調(diào)的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9進一步分析驗證，結(jié)果表明它們在誘導分化后的第28天仍然持續(xù)高表達，提示可能參與了MSCs向軟骨分化的全過程。羅嘉全等[18]利用生物分析軟件分析了在MSCs成骨過程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相關(guān)的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNAs在MSCs成骨分化后其表達均較分化前下調(diào)，其中3個lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）變化有統(tǒng)計學意義。其可能的機制是通過正向調(diào)控Smurf1，促使Smurf1表達下調(diào)，進而減少Runx2的降解，最終促進MSCs的成骨過程。左長清等[19]用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了116個在MSCs成骨過程中差異表達的lncRNAs，細胞實驗進一步證實lncRNA AK089560的表達值在C3H10T1/2 細胞成骨分化的第2，4，6天明顯下降，可能的機制是它參與維持MSCs處于未分化狀態(tài)；進一步分析發(fā)現(xiàn)[20]，116個表達變化的lncRNAs中59個表達上調(diào)，57個則是表達下調(diào)；其中60.3%是基因間結(jié)構(gòu)區(qū)域，另20.7%是位于編碼區(qū)域；且24個lncRNAs都能找到相應的毗鄰編碼基因所匹配，提示它們可能是lncRNAs的調(diào)控目標基因。例如EGFR是成骨促進因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通過調(diào)控表皮生長因子受體信號通路來負向影響成骨過程；lncRNA NR_027652則通過影響DLK1、lincRNA0243通過影響IL-5參與了MSCs的成骨過程。程晨等[21]發(fā)現(xiàn)在MSCs成骨過程中表達明顯下調(diào)的lncRNAs有24條，細胞實驗進一步證實其中AK035085可能通過對成骨過程中關(guān)鍵基因抑制來起作用。Wang等[22]同樣用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些在成骨分化過程中的重要lncRNAs，最終證實lncRNA H19和uc022axw.1的表達上調(diào)可能參與了MSCs成骨分化的過程。Zhu等[23]報道，lncRNA-ANCR可以維持成骨細胞的非分化狀態(tài)，其分子機制主要是通過與EZH2作用來抑制Runx2蛋白的表達，從而導致成骨分化降低；相反，下調(diào)lncRNA-ANCR則可促進成骨分化。

MSCs在不同的解剖區(qū)域有不同的生物學活性，Dong等[24]據(jù)此通過芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表達差異情況，發(fā)現(xiàn)了457個表達上調(diào)及513個表達下調(diào)的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表達，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些則相比骨髓MSCs低表達，如NR 037182、NR 037595和 XR 111050。作者還同時檢測了相關(guān)的mRNA表達情況，并用生物信息學技術(shù)構(gòu)建起一個lncRNAs-mRNA模型，分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs可能通過影響相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進而影響了諸如凋亡、MAPK、Wnt等復雜的信號通路，最終影響到細胞的凋亡、增殖與分化過程，它們很可能也參與了MSCs的成骨分化進程。

有報道稱MSCs細胞有致瘤傾向，Shoshani等[25]發(fā)現(xiàn)lncRNA H19高表達，則這種傾向更明顯，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向調(diào)控作用，它也可以成為MSCs致瘤過程中的一個潛在治療靶點；Liu等[26]的研究成果表明lncRNA HOTAIR也參與了表皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程。在骨髓瘤細胞向MSCs轉(zhuǎn)化過程中，lncRNA MALAT1可通過影響LTBP3基因表達參與了整個轉(zhuǎn)化過程[27]。這些研究一定程度上拓展了人們對lncRNAs在MSCs生物學功能影響方面新的認識。

4 小結(jié)與展望

基因的經(jīng)典功能是編碼對細胞生命活動至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，但是占基因絕大部分的非蛋白編碼序列則是由包括micro RNAs、lncRNAs等在內(nèi)的調(diào)控序列組成。隨著二代測序技術(shù)和生物信息學技術(shù)的不斷成熟，大量的lncRNAs被發(fā)掘出來，初期的研究成果已經(jīng)表明，lncRNAs參與了細胞分化、個體發(fā)育等重要生命活動的整個調(diào)控過程，并與人類的諸多重大疾病密切相關(guān)。DNA元件百科全書（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）計劃已經(jīng)在人類基因組中鑒定了9000余條lncRNAs，但其中具有明確生物學功能的僅有100條左右[28]，大量的基因“富礦”有待人類去開發(fā)。

相比其他細胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，雖然前期研究僅停留在生物芯片與生物信息學分析層面，其強大的研究潛力已經(jīng)呈現(xiàn)出來。基于lncRNAs在生命領(lǐng)域的強大功能，隨著新的研究技術(shù)體系的建立，lncRNAs在調(diào)控間充質(zhì)干細胞分化、增殖、凋亡等重要生命活動中的確切分子機制最終將得以闡釋。

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（收稿日期：2015-03-31 本文編輯：蘇 暢）