藍點馬鮫頭腎cDNA文庫的構建及鑒定

王丹妮+劉軍

摘 要：研究運用SMART技術對藍點馬鮫頭腎構建了cDNA文庫，該文庫原始文庫滴度為2.26×106pfu/mL，文庫容量為1.36×106pfu，符合文庫構建的要求。從文庫中隨機挑選24個單克隆菌，以載體的通用引物進行菌落檢測PCR，結果表明：重組率為95.8%，插入片段大小平均為1 000bp。該文庫的構建滿足了基因的分離與篩選，為進一步研究其相關基因克隆及分子生物學研究奠定基礎。

關鍵詞：藍點馬鮫；頭腎；cDNA文庫；構建

中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）17-36-03

Construction of cDNA Libraries and Identification of Head Kidney from Scomberomorus niphonius

Wang Danni et al.

（China filiang university，HangZhou 310018，China）

Abstract：cDNA library of Scomberomorus niphonius head kidney was constracted by SMART technology.The original library titer is 2.26×106pfu/mL，and library capacity is 1.36×106pfu，meeting the requirements of library construction. RandomLy selected 24 monoclonal bacteria from the library，subjected to colony PCR detected by using universal primers. The results showed that recombination rate was 95.8%，an average insert size was 1 000bp. Construction of the library meet the isolation and screening of gene，and lay the foundation for further study of melecμlar biology and gene cloning.

Key words：Scomberomorus niphonius；Head kidney；cDNA library；Construction

目前，分離基因最快、最有效的技術是cDNA文庫的構建。cDNA文庫是一種重組的克隆基因群，是以組織中的mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA，并與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接轉化而形成的，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫[1]。與其他文庫相比，cDNA文庫中獲得的基因組是已經剪切將內含子去除的cDNA，因此可以在cDNA文庫中便捷地獲取基因序列的信息[2]。

藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius）屬于輻鰭亞綱、鱸形目，鯖亞目、鯖科、馬鮫屬，普遍分布于北太平洋的西邊以及中國東海、黃海、渤海及南海（以海南文昌鋪前附近海域最為著名）等地。該魚體長而扁平，紡錘形，是北方海經濟魚類。在硬骨魚的體內存在著頭腎，位置在全腎的最前端，這個部位屬于淋巴組織，具有免疫的功能，可以制造白血球以及消滅陳舊的紅血球的功能。由于近年來人們對藍點馬鮫的肆意捕撈以及環境的不斷惡劣，導致藍點馬鮫的產量急劇減少。本研究通過構建藍點馬鮫的cDNA文庫，尋找一些具有特殊功能的基因，為其深入的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 2014年5月在浙江省寧波市象山港捕撈藍點馬鮫樣本12尾（平均重750±5g），取其頭腎組織，并快速保存于液氮中，存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA 取藍點馬鮫的頭腎組織，至于液氮中研磨，運用TRzol法提取總RNA，并取3μL進行瓊脂糖凝膠電泳分析，以確定RNA的質量，并運用紫外分光光度計對RNA的純度和濃度進行檢測。

1.2.2 cDNA雙鏈的合成 在一個200μL滅菌離心管中依次加入下列試劑，RNA（1μg），加DEPC水補足到3.25μL；5-Oligo（RT）（20μM）0.5μL；DMSO為0.5μL；然后72℃溫浴3min，冰上冷卻3min，短暫離心后，再依次加入下列試劑：5×First Srand Buffer 2μL，20Mm DTT（Clontech）1μL，dNTPs Mix 1μL，RNase inhibitor（40U＼μL）0.25μL；SMART Scribe RTase（Clontrch）1μL；反應條件42℃溫浴1h，70℃15min，冷卻到室溫.然后進行第二鏈合成。在第二鏈合成離心管中依次加入First Strand cDNA 2μL，去離子水80μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL，50xdNTPs Mix 2μL，5PCR引物，3PCR引物2μL，及50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL，混勻，反應條件：94℃、2min；98℃、10s，60℃、30s，68℃、3min，25個循環。反應完成后，取5μL用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余放于-20℃保存備用。

1.2.3 cDNA與質粒載體的連接及轉化 產物與pUCm-T載體用T4連接酶連接，反應體系如下：PCR產物1μL，pUCm-T載體1μL，2×快連buffer2.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL；反應條件：22℃、8min。將連接產物轉入DH5α中，冰上放置30min，熱擊90s，然后再放回冰上3min，添加 600μLSOC無抗液體培養基，37℃，200振蕩復蘇培養1h，獲得了藍點馬鮫頭腎初始cDNA文庫。

1.2.4 cDNA文庫的容量測定 從文庫中取出10μL菌液，用SOC培養基分別稀釋10、100、1 000、10 000倍，然后再分別吸取100μL涂板，37℃豐培養16h。計算平板的總克隆數，公式如下：文庫滴度=平板上的克隆數×稀釋倍數/涂板體積）[3]，文庫容量=庫包裝體積×滴度[4]。分別計算出cDNA文庫滴度和庫容量。

1.2.5 cDNA文庫的質量鑒定 cDNA文庫的質量鑒定主要有2種方法：一是檢測文庫的重組率，二是對插入片段的檢測。通過應用藍白斑篩選來鑒定文庫的重組率，計算公式為：重組率（%）=白斑數/（白斑數+藍斑數）×100[5]。對其插入片段的檢測，隨機挑取單克隆菌，進行菌液檢測PCR，PCR反應條件為預變性94℃、5min；94℃、1min，55℃、30s，72℃、2min，35個循環；72℃延伸5min。反應結束后，進行瓊脂糖電泳的檢測，然后篩選陽性菌送測序。

1.2.6 序列分析 利用NCBI中的VecScreen程序識別所測序列并去除載體，利用DNAStar軟件SeqMan程序比對序列，將得到在GenBank上進行BLAST比對分析后的生物EST序列。

2 結果與分析

2.1 提取總RNA和分離mRNA 總RNA的提取純度要高，完整性較好，這是構建cDNA文庫的基礎。本研究選用試劑盒從藍點馬鮫頭腎中獲得RNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明（見圖1）：18s和28s的條帶都比較完整和清晰，28s條帶的濃度是18s的2倍，且未發現拖尾現象，說明所提取的RNA完整性好，質量較高。經紫外分光光度計檢測后，RNA濃度為均在295～325ng/μL，而且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明RNA的純度較高，并且達到了反轉錄所需的RNA濃度，可以用于cDNA文庫的構建。

圖1 藍點馬鮫總RNA電泳

2.2 cDNA文庫滴度的測定 cDNA文庫主要是通過文庫滴度和文庫容量來檢測的。通過公式計算之后，原始文庫滴度為2.26×106pfu/mL，文庫容量為1.36×106pfu，而SMART文庫構建要求未擴增文庫的滴度大于1×106pfu/mL，所以符合建庫的要求。

2.3 cDNA文庫插入片段的測定 從文庫中隨機挑取24個單克隆菌，每個菌落加600μL含Amp抗生素的SOC液體培養基，用載體的通用引物進行菌落檢測PCR。檢測結果（圖2）表明，挑選的這24個菌中，有23個出現了清晰條帶，條帶主要集中在1～2kb。根據公式可計算出該藍點馬鮫的頭腎cDNA文庫的重組率為95.8%，而且所構建的cDNA文庫中cDNA的插入片段分布均勻，呈現出大小不一的擴增片段?？梢姡緦嶒灣晒Φ臉嫿怂{點馬鮫頭腎的cDNA文庫，為后續篩選一些有功能的蛋白奠定了良好的基礎。

圖2 菌落檢測PCR電泳

2.4 測序及EST分析 從cDNA原始文庫中挑取50個單克隆菌進行測序，利用NCBI中的VecScreen程序對所測序列進行分析，并去掉載體、短序列及一些相對分子量較低的序列后，共獲得了46個有效序列，將獲得的EST序列利用NCBI的BlastX進行相似性比對分析，選擇一些具有代表性的序列進行分析（見表1）。

表1 藍點馬鮫cDNA文庫部分EST

[克隆編號＼&長度（bp）＼&相似度（%）＼&相似基因來源的物種名＼&推定蛋白種類＼&推定蛋白功能＼&S3＼&981＼&90＼&奈里樸麗魚＼&泛素連接酶＼&是蛋白質降解的信號＼&S4＼&983＼&86＼&深裂眶鋸雀鯛＼&甲基轉移酶＼&能引起氨基酸轉移＼&S8＼&1073＼&90＼&斑馬宮麗魚＼&真核翻譯起始因子＼&參與真核生物的翻譯＼&S11＼&992＼&89＼&斑馬宮麗魚＼&鈣網蛋白＼&調節細胞內鈣離子＼&S13＼&1028＼&86＼&大黃魚＼&CSRP2蛋白＼&促進細胞進入有絲分裂＼&S16＼&936＼&83＼&尼羅非魚＼&鋅指蛋白＼&調控基因轉錄＼&S27＼&1060＼&90＼&大黃魚＼&肽鏈釋放因子＼&調控細胞周期，組建細胞骨架＼&S29＼&980＼&96＼&安大略鮭＼&促分裂素活化蛋白＼&促進細胞分裂＼&S36＼&1028＼&91＼&尼羅非魚＼&SH3結構域蛋白＼&介導信號分子與富含脯氨酸的蛋白分子結合＼&S37＼&982＼&90＼&紅旗東方鲀魚＼&絲/蘇氨酸蛋白激酶＼&刺激胞外基質合成＼&S39＼&1013＼&88＼&慈鯛類＼&輸入蛋白＼&幫助核蛋白進入細胞核＼&S48＼&956＼&89＼&布氏新亮麗鯛＼&KLF轉錄因子＼&參與細胞增殖、凋亡和分化＼&S54＼&923＼&87＼&大黃魚＼&PDZ結構域＼&調控蛋白質之間相互作用＼&S74＼&952＼&90＼&尼羅非魚＼&BTG1蛋白＼&參與細胞代謝＼&]

3 討論與結論

cDNA文庫的構建是一種基礎工具，可以研究基因的功能和發現新基因，因而被廣泛運用于生物學研究領域中。目前通過cDNA文庫篩選已經發現了許多基因[6]，而以藍點馬鮫為原材料構建cDNA文庫尚未報道。本研究通過提取RNA，采用In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技術，構建藍點馬鮫頭腎cDNA文庫，并通過對其容量、質量的檢測，從而判斷該文庫的參考價值的。

本實驗所構建的原始cDNA文庫的滴度為

2.26×106pfu/mL，而構建文庫一般要求其滴度≥1×106pfu/mL，與目前已經構建的cDNA文庫比較，例如張少會等[7]構建的草莓果實cDNA文庫原始滴度為1.13×106pfu/mL；韋春梅等[8]構建松墨天牛幼蟲的cDNA文庫原始滴度為5.45×106pfu/mL；陳美元[9]構建了雙孢蘑菇As2796全長cDNA文庫的原始滴度為3.3×106pfu/mL，經過查閱文獻及比較，表明本研究所構建的文庫是可以滿足之后實驗的需要。此外，對其插入片段進行檢測，其片段長度平均為1 000bp。

高質量的RNA是活的cDNA的基礎，RNA的純度和完整性決定著cDNA文庫信息的完整性[10-11]。本實驗為了提高RNA的質量，不經過mRNA的純化過程，直接用總RNA來建庫，減少了mRNA的降解和丟失，可以使mRNA最大限度的轉錄為cDNA。此外，在LD-PCR中，設置25個循環，合成了足量的cDNA，使文庫的表達序列變得富集。

參考文獻

[1]薩姆布魯克J，拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[M].第3版.北京：科學出版社，2002.

[2]CARNINCI P，SHIBATA Y，HAYATSU N，et al.Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes[J].Genome Res，2000，10（10）：1617-1630.

[3]王楠，周瑩，姚丹，等.春大豆花芽cDNA文庫的構建及質量分析[J].華南農業大學學報，2014，35（1）：73-78.

[4]蔣晶，肖熙鷗，曹必好，等.茄子青枯病誘導的cDNA文庫構建與鑒定[J].江蘇農業科學，2014，42（4）：22-24.

[5]張雨良，張樹珍，王健華，等.感染高粱花葉病毒甘蔗葉片cDNA文庫構建及評價[J].熱帶作物學報，2012，33（6）：1096-1100.

[6]范睿，凌鵬，顧文亮，等.海南蒟cDNA文庫的構建及評價[J].熱帶作物學報，2013，34（4）：36-640.

[7]張少會，沈元月.草莓果實cDNA文庫的構建及鑒定[J].北京農業學院學報，2014，29（2）：12-14.

[8]韋春梅，羅淋淋，吳華俊，等.松墨天牛幼蟲cDNA文庫的構建及EST分析[J].基因組學與應用生物學，2014，33（1）：113-120.

[9]陳美元.雙孢蘑菇As2796全長cDNA文庫的構建及鑒定[J].福建農業學報，2012，27（11）：1201-1204.

[10]黃功華，梁景耀.酵母細胞中構建HL-60細胞的酵母雙雜交cDNA文庫[J].廣東醫學院學報，2004，22（1）：1-3.

[11]湯華，鄭用璉.玉米耐鋁毒基因的分離[J].植物生理與分子生物學學報，2005，31（5）：507-514. （責編：張宏民）