食管鱗癌組織和血漿中COL14A1基因的甲基化及與臨床特征的關系

鄭燕芳　李許鋒　蔣春雨　周福有　王貽諾　張積仁★

·論著·

食管鱗癌組織和血漿中COL14A1基因的甲基化及與臨床特征的關系

鄭燕芳李許鋒蔣春雨周福有王貽諾張積仁★

目的 對比分析食管鱗癌組織和癌旁組織，食管鱗癌患者與正常人的血漿，檢測COL14A1的甲基化頻率，并結合患者的臨床病理特征，分析COL14A1基因甲基化與食管鱗癌的臨床特征的關系。 方法 收集42例食管鱗癌組織標本和相對應的癌旁組織標本，同時收集42例食管鱗癌患者和50例正常人的血漿標本；應用甲基化特異性PCR（MSP）結合瓊脂糖凝膠電泳檢測COL14A1在組織和血漿中的甲基化情況。 結果 COL14A1在腫瘤組織中的甲基化頻率為 45.24%，顯著高于癌旁組織11.9%（P＜0.001）。COL14A1在腫瘤患者血漿中的甲基化頻率為30.95%，在正常對照組的血漿中未檢測到甲基化。組織中的COL14A1甲基化頻率在病理分期為N2組明顯高于病理分期N0-N1組。血漿中的COL14A1甲基化頻率在病理分期T3組明顯高于病理分期T1～T2組。 結論 COL14A1在食管鱗癌組織的甲基化頻率高于癌旁組織，在食管鱗癌患者血漿中的甲基化頻率顯著高于正常人，且臨床分期越晚的甲基化頻率越高。

食管鱗癌 甲基化 COL14A1基因 表觀遺傳學

食管癌是我國常見惡性腫瘤之一，其中河南林州為世界最高發地區。我國食管癌病理類型以鱗癌多見，＞90%［1］。研究發現，早期癌變即可引起基因的甲基化異常改變，并且DNA甲基化變異可在體液和早期病變活檢組織中檢測到［2］。另外，DNA甲基化可通過去甲基化藥物干預逆轉，提示基因的甲基化異常可能作為早期發現食管癌變和治療干預的生物靶點［3］。在前期芯片研究中，作者發現COL14A1基因啟動子區甲基化在食管鱗癌和癌旁組織之間存在差異［4］，為了進一步驗證這一發現，本文進行了腫瘤組織樣本和血液樣本的驗證，并且分析了COL14A1的甲基化與患者臨床病理特征間的關系。報道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 42例腫瘤組織和配對的癌旁組織于2012年6月至9月收集于河南省安陽市腫瘤醫院，并與患者及家屬簽署知情同意書。所有標本經手術切除后，立即取腫瘤組織和癌旁組織，置于液氮中，后期-80℃低溫儲存，直至使用。所有標本手術前未接受過化療、放療等針對腫瘤的治療，所有標本經病理科副高級以上職稱病理確診為食管鱗癌組織和正常癌旁組織。同時用EDTA抗凝管收集患者5ml血液，離心收集血漿，-80℃低溫保存，直至使用。50例健康對照的血液樣本來源于安陽市腫瘤醫院內鏡中心，內鏡排除上消化道腫瘤的健康志愿者，簽署知情同意書后采血，離心收集血漿，-80℃低溫保存。收集標本的試驗流程取得安陽市腫瘤醫院倫理委員會同意。

1.2組織DNA的提取 組織DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，按說明書操作。取25mg組織加入80μl PBS中，用勻漿器充分攪打；加入100μl Buffer ATL，20μl 蛋白酶K，充分混勻，56℃溫育至組織充分裂解。加入4μl RNase A（100 mg/ml），混勻，室溫溫育2min；加入200μl Buffer AL，混勻，70℃溫育10min，短暫離心。加入200μl 無水乙醇，混勻15s，短暫離心，加入QIAamp I spin column中（200μl樣本：200μl 無水乙醇），離心棄廢液。加入500μl AW1，離心棄廢液；加入500μl AW2，離心棄廢液；QIAamp I spin column管離心，最高速1 min；加入30μl ddH2O于硅膠膜中央，室溫孵育1min，離心洗脫DNA，為提高得率可重復一次洗脫。

1.3血漿DNA的提取 將200μl血漿加入到1.5 ml離心管里，加入20μl proteinaseK，充分混勻；加入200μl Buffer AL，充分混勻15s，56℃溫育10min，短暫離心。加入200μl無水乙醇，混勻15s，短暫離心。加入QIAamp mini spin column中，200μl樣本加200μl無水乙醇。離心，8000r/min，棄廢液；加入500μl AW1，離心，8000r/min，棄廢液；加入500μl AW2，離心，14000r/3min，棄廢液；QIAamp mini spin column管離心，20000r/min 1min。加入30μl ddH2O于硅膠膜中央，室溫孵育1min，離心，8,000r/min，洗脫DNA，為提高得率可重復1次洗脫。

1.4甲基化特異性PCR（MSP）反應 亞硫酸鹽修飾試劑盒購自上海博升生物科技有限公司，按說明書操作。基因啟動子區甲基化狀態檢測采用甲基化特異性PCR（MSP）法。該方法基本原理是運用亞硫酸氫鈉處理DNA樣本，通過化學作用，非甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。根據待測DNA序列，分別設計甲基化和非甲基化兩套不同的引物對，在后續PCR反應中，若甲基化引物能夠擴增出條帶，則說明樣品待測位點的CPG島中胞嘧啶呈甲基化狀態，若非甲基化引物能夠擴增出條帶，則說明樣品待測位點的CpG島中胞嘧啶是非甲基化的"陽性對照采用M.5551CpG甲基化酶（購自New England Biolabs公司）修飾胎盤DNA獲得，同時設置雙蒸水為陰性對照。COL14A1基因的甲基化PCR的引物序列見表1。

表1　COL14A1基因的甲基化PCR的引物序列

1.5電泳分析 取PCR產物進行3%瓊脂糖（西班牙產，購自北京鼎國生物技術有限責任公司）凝膠電泳，EB染色后在紫外透射儀（TL一2000，TranS-1inker，Upland，USA）上觀察結果，在凝膠成像系統（Imagemaster，PharmaliaBioteeh，USA）上攝片留存。1.6 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件。統計分析方法為χ2檢驗，多重檢驗經P值校正，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1COL14A1在食管鱗癌和癌旁組織中甲基化差異分析 通過甲基化特異性PCR，在42對食管鱗癌組織和配對的癌旁組織中研究COL14A1的啟動子區甲基化狀態。甲基化PCR的結果見圖1，在所有樣本中均檢測出了非甲基化。甲基化特異性PCR分析顯示，在食管鱗癌組織和癌旁組織標本中COL14A1基因的甲基化頻率分別為54.8%和9.5%，食管鱗癌組織中的甲基化頻率明顯高于癌旁組織（表2）。

圖1　COL14A1基因甲基化特異性PCR后的電泳檢測圖。T：腫瘤組織，S：癌旁組織，TBP：腫瘤患者血漿，M：分子量對照（marker），P：陽性參照，N：陰性參照。

表2　COL14A1在42例腫瘤組織和對應的癌旁組織中的甲基化狀態

2.2COL14A1的甲基化狀態與食管鱗癌患者臨床資料的關系 病理分期為N2組的GPX3基因甲基化頻率，明顯高于病理分期為N0～N1組，差異有顯著性（P＜0.001）。COL14A1的甲基化頻率在性別、年齡、腫瘤家族史、腫瘤大小、病理分化程度、吸煙、飲酒之間差異無統計學意義。

2.3COL14A1在腫瘤患者血漿及健康對照血漿中的甲基化差異 檢測42例腫瘤患者和50例健康志愿者血漿游離核酸中COL14A1的甲基化狀態。在食管鱗癌患者的血漿中，COL14A1的甲基化頻率為40.5%，在健康志愿者的血漿中未檢測到COL14A1的甲基化，差異有顯著性（P＜0.01）。

2.4食管鱗癌患者血漿游離核酸中COL14A1甲基化狀態和臨床資料的關系 分析發現，病理分期T3組和病理分期T1～T2組比較，GPX3的甲基化頻率較高，差異有統計學意義（P=0.015）。在不同性別、年齡、腫瘤家族史、腫瘤大小、腫瘤細胞分化程度、腫瘤病理分期、吸煙、飲酒分組中，COL14A1的甲基化頻率差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3　討論

表觀遺傳學是研究核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達發生可遺傳變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳現象主要包括DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾等［5］。其中DNA甲基化是最為重要，也是目前研究最為深入一種表觀遺傳學形式［6］。DNA甲基化是指在DNA雙螺旋中，DNA甲基轉移酶催化下，活性甲基被轉移到特定堿基的過程［7］。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在二核苷酸胞嘧啶（CpG）的第5位碳原子上，形成5`-甲基胞嘧啶。研究［8］表明，DNA甲基化在腫瘤發生發展過程中有重要作用，是腫瘤發生的早期事件之一，具有潛在的腫瘤標志物意義。

COL14A1是一種存在于細胞外基質中與膠原纖維成熟相關的大分子糖蛋白，而細胞外基質成分的改變被認為與腫瘤進展和轉移有關。COL14A1與核心蛋白聚糖關系密切［9］，后者是一種小分子富亮氨酸蛋白聚糖，已逐步被證明可強烈抑制多種腫瘤細胞生長，這種抑制作用可能由其核心蛋白與表皮生長因子受體和其他ErbB家族蛋白介導［10］。在腎癌細胞系和原發性腎癌中曾檢測到COL14A1基因啟動子區域高甲基化狀態，且高甲基化與基因沉默和mRNA下調相關聯［11，12］。本課題前期的芯片篩選試驗中，發現食管鱗癌組織中也存在COL14A1基因啟動子區域高甲基化狀態。

本研究以前期高通量甲基化芯片篩選實驗數據為基礎，對我國食管鱗癌高發區食管鱗癌患者腫瘤組織及血漿游離DNA中COL14A1基因啟動子區域甲基化狀態進行檢測分析，并探討其與食管鱗癌臨床特征的關系。結果顯示，COL14A1在食管鱗癌組織的甲基化頻率高于癌旁組織，在食管鱗癌患者血漿中的甲基化頻率顯著高于正常人。組織中的COL14A1甲基化頻率在病理分期為N2組明顯高于病理分期N0～N1組，血漿中的COL14A1甲基化頻率在病理分期T3組明顯高于病理分期T1～T2組。說明COL14A1基因的甲基化可能與腫瘤的浸潤和轉移有關。

食管鱗癌組織中COL14A1基因啟動子區域存在異常高甲基化狀態，這為食管鱗癌表觀遺傳學發病機制研究提供了新的線索。血漿游離DNA較為準確地反映了組織中COL14A1基因啟動子區域甲基化狀態的情況。由于血漿標本取材較為簡單、基本無創，有較大的腫瘤標志物潛在價值［13，14］。相信隨著更多大樣本多中心研究的開展，血漿游離DNA中甲基化狀態分析一定能為食管鱗癌的診斷和預后判斷提供有力的幫助。

1 赫捷， 邵康. 中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策.中國癌癥雜志， 2011，21（7）： 501～504.

2 Belinsky S A， Nikula K J， Palmisano W A， et al. Aberrant methylation of p16（INK4a）is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc Natl Acad Sci U S A， 1998，95（20）： 11891～11896.

3 Esteller M. DNA methylation and cancer therapy： new developments and expectations. Curr Opin Oncol， 2005，17（1）： 55～60.

4 Li X， Zhou F， Jiang C， et al. Identification of a DNA methylome profile of esophageal squamous cell carcinoma and potential plasma epigenetic biomarkers for early diagnosis . PLoS One，2014，9（7）： e103162.

5 Bird A. Perceptions of epigenetics. Nature， 2007，447（7143）： 396-398.

6 Jones P A， Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science， 2001，293（5532）： 1068～1070.

7 Bird A P， Wolffe A P. Methylation-induced repression--belts， braces，and chromatin. Cell， 1999，99（5）：451～454.

8 Jones P A， Baylin S B. The epigenomics of cancer. Cell， 2007，128（4）：683～692.

9 Ehnis T， Dieterich W， Bauer M，et al. Localization of a Binding Site for the Proteoglycan Decorin on Collagen XIV（Undulin）. Journal of Biological Chemistry， 1997， 272（33）： 20414～20419.

10 Sofeu Feugaing DD， Gotte M， Viola M. More than matrix： the multifaceted role of decorin in cancer. Eur J Cell Biol， 2012， 92（1）：1～11.

11 Ibanez de Caceres I， Dulaimi E， Hoffman Amanda M， et al. Identification of novel target genes by an epigenetic reactivation screen of renal cancer. Cancer Res， 2006， 66（10）： 5021～5028.

12 Morris MR， Ricketts C， Gentle D， et al. Identification of candidate tumour suppressor genes frequently methylated in renal cell carcinoma. Oncogene， 2010， 29（14）： 2104～2117.

13 Ikoma D， Ichikawa D， Ueda Y， et al. Circulating tumor cells and aberrant methylation as tumor markers in patients with esophageal cancer. Anticancer Res， 2007， 27（1B）： 535～539.

14 Schwarzenbach H， Hoon DS， Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat Rev Cancer， 2011，11（6）： 426～437.

Objective To detect COL14A1 gene methylation frequency difference between esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）tissues and control normal tissues，between ESCC patients'plasma and healthy volenteers' plasma，and to analyze the correlation with clinicopathological parameters. Methods We collected esophageal squamous cell carcinoma tissues（n=42 cases）and adjacent surrounding normal tissues（n=42 cases），plasma of the esophageal squamous cell carcinoma（n=42 cases）and plasma of the healthy individuals（n=50 cases）. We used Methylation specifi c PCR（MSP）combined with agarose gel electrophoresis to detect the methylation status of the COL14A1. We used SPSS 13.0 software for statistical analysis by χ2test and Fisher's exact test. Results GPX3 frequency of methylation in tumor tissue was 54.8%，signifi cantly higher than the adjacent tissues which was 9.5%，the difference was statistically signifi cant（χ2=28.873，P＜0.001，n=84）. In the plasma of cancer patients GPX3 methylation frequency was 40.5%，while the methylation of COL14A1 in the plasma of healthy volunteers was not detected. Methylation of GPX3 in tissue was more frequently seen in patients with T3 or N2 than in patients with T1-2 or N0-1. Conclusion The methylation frequency of COL14A1 is higher in ESCC tissus than in control normal tissues，and higer in plasma of ESCC patients than in healthy volunteers. GPX3 methylation was more frequently seen in patients with more advanced disease.

Esophageal squamous cell carcinoma GPX3 gene DNA methylation Epigenetics

國家自然科學基金青年項目（81202073）

510282 南方醫科大學珠江醫院腫瘤中心（鄭燕芳 李許鋒 張積仁）455000 河南省安陽市腫瘤醫院放療科（蔣春雨 周福有）200433 上海分子靶向研究所（王貽锘）*通訊作者