羥乙基淀粉復合烏司他丁對保護重度休克大鼠腸通透性作用的研究

李寶永　蒲國華　許景偉

羥乙基淀粉復合烏司他丁對保護重度休克大鼠腸通透性作用的研究

李寶永蒲國華許景偉

目的 探究烏司他丁、羥乙基淀粉對保護腸黏膜控制內毒素（ET）通過通透性增強的腸壁進入循環血液的作用。方法 健康雄性大鼠85只，隨機分為正常對照組（Ⅰ組，n=5）、重度休克組（Ⅱ組，n=40）、羥乙基淀粉烏司他丁干預重度休克復蘇組（Ⅲ組，n=40），后兩組又分為5個時相點，即1h、2h、4h、8h、16h，各時間點8只大鼠。采用比色法檢測二胺氧化酶（DAO）表達變化。采用光度法檢測ET表達變化。結果 Ⅲ組從復蘇開始DAO含量即較Ⅱ組低近1倍，而且8hⅡ組達到了最高峰，而Ⅲ組卻急速下降。兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內不同時間點之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。Ⅲ組的血清ET于1h時雖然較正常含量仍高出34倍之多，但較Ⅱ組要低近1倍，至16h時幾乎接近了正常含量，兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內不同時間點之間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 ET、DAO含量測定是判斷小腸通透性改變的敏感性指標。羥乙基淀粉烏司它丁對于降低重度創傷-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有顯著性效果。

重度休克 二胺氧化酶 內毒素 羥乙基淀粉 烏司它丁

大量研究表明，內毒素（ET）血癥對重度創傷患者的轉歸起著重要的作用［1～3］。作者自2013年2月至2014年8月根據應用羥乙基淀粉及烏司它丁復蘇后，通過測定不同時間窗大鼠血清二胺氧化酶（DAO）［4］、ET水平，以探究羥乙基淀粉及烏司它丁復蘇對保護腸黏膜、控制ET通過通透性增強的腸壁進入循環血液的作用［5～7］。

1　材料與方法

1.1動物選擇及分組 雄性SD大鼠85只（SPF級），體重（300±20）g，飼養5d，12h光/黑循環。實驗大鼠分為3組：正常對照組（Ⅰ組，只=5）、重度休克組（Ⅱ組，只=40）、羥乙基淀粉烏司它丁干預重度休克復蘇組（Ⅲ組，只=40）。Ⅰ組實驗動物分別稱重，由下腔靜脈抽取血液3ml進行DAO、ET檢測。Ⅱ組為重度休克組（只=40）：于1h、2h、4h、8h、16h不同時間窗由下腔靜脈抽取血液3ml進行DAO、ET檢測。Ⅲ組經股靜脈輸注羥乙基淀粉（0.02ml/g）烏司它丁（6U/g），然后在休克模型成功復制并穩定30min后1h、2h、4h、8h、16h不同時間窗，于下腔靜脈抽取血液3ml，進行DAO和ET檢測，每一亞組實驗大鼠為8只，共40只。

1.2主要儀器及試劑 ET測定儀，BL-410生物機能試驗系統，手術器械，分析天平，酶標儀，ET酶聯免疫分析試劑盒，DAO酶聯免疫分析試劑盒，羥乙基淀粉，烏司它丁。

1.3休克模型的復制 按照重度創傷-失血性休克大鼠模型標準［8］，取SD大鼠稱重后，以10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔注射麻醉，固定并消毒。（1）分離一側頸內動、靜脈，行動靜脈置管。頸動脈導管與BL-410生物機能實驗系統相連，監測MAP。（2）分離右股動脈并插管，用于放血。（3）游離右側股骨，咬碎股骨干后縫合。（4）經致內靜脈導管注入肝素（1250U/kg）使全身肝素化后經股動脈導管緩慢放血，在10min內使MAP降至（35±5）mmHg，完成模型的復制。

1.4血清的采集及存放 常規消毒打開大鼠腹腔，顯露下腔靜脈及門靜脈，分別留取靜脈血3ml，4℃過夜，3000r/min，低溫離心10min，取血清各0.3ml，分裝EP管中置于-70℃冰箱保存備用（測DAO和ET）。

1.5ET的檢測 用ET專用采血瓶加入1ml靜脈全血，離心（1500r/min，10min），然后取0.2ml血漿加入稀釋液瓶中（內含0.8ml稀釋液），75℃水浴加熱10min備用。在上機專用試管中加入0.1ml鱟試劑，再加入1ml已處理的備用液，使試管內溶液混勻，然后把各試管按編號逐次插入檢測儀反應孔中，自動處理數據。

1.6DAO的檢測 （1）將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫。（2）標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50μl于反應孔內。（3）加入稀釋后的標準品50μl于反應孔、加入待測樣品50μl于反應孔內。立即加入50μl的生物素標記的抗體。緩慢振蕩混勻，37℃溫育1h。（4）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復3次。（5）每孔加入80μl的親和鏈酶素（HRP），緩慢振蕩混勻，37℃溫育30min。（6）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復3次。（7）每孔加入底物A、B各50μl，緩慢振蕩混勻，37℃溫育10min。避免光照。（8）取出酶標板，迅速加入50μl終止液，加入終止液后應立即測定結果。（9）在450nm波長處測定各孔的OD值。計算：以標準物的濃度為縱坐標（對數坐標），OD值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.7統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，各組數據均作正態性檢驗及方差齊性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血清DAO檢測結果 見表1。

表1　血清DAO檢測結果［U/L，（x±s）］

2.2血清ET檢測結果 見表2。

表2　血清ET檢測結果［pg/ml，（x±s）］

3　討論

創傷-失血性休克是臨床上常見的危重癥之一。機體在發生創傷-失血性休克的發展過程中，腸道起著重要的作用［9，10］。腸道被認為是最大的革蘭陰性桿菌ET池。生理解剖的特點決定了腸黏膜以及小腸絨毛是胃腸道缺血缺氧最敏感部位［11，12］，而且亦是恢復最晚的器官。休克發生后，胃腸道出現缺血［13～15］，其最早的表現即為腸道通透性增高，從而導致ET經腸黏膜吸收的增多。

DAO是人類和所有哺乳動物腸黏膜上皮絨毛細胞胞漿中具有高度活性的細胞內酶，在外周血中活性穩定，是反映腸黏膜上皮細胞成熟度和完整性的相對穩定的血漿標記物。其對腸黏膜損傷引起腸道通透性的增加早期診斷敏感而且特異性強。

ET是革蘭陰性（G-）桿菌外膜的重要組成部分，正常腸道中，細菌在復制過程中外膜碎片不斷脫落，使腸內游離ET處于高水平，即使有少量的細菌、毒素通過了腸道屏障，也會被腸道的淋巴組織，脾臟、肝臟的網狀內皮系統所清除，不會對機體造成損害。當發生休克時，各臟器血流灌注不足導致缺血，腸道亦不例外，從而導致腸道屏障功能損傷，腸黏膜通透性增加，使細菌、ET透過腸道屏障移位入血；同時，發生休克時腸黏膜的免疫功能受損，機體不能有效地清除侵入的致病菌，亦是促使細菌、ET易侵入血的一個重要原因。本實驗顯示Ⅱ組的血清ET隨著時間的推移在逐漸增加，較正常含量高出50余倍。而Ⅲ組的血清ET于1h時雖然較正常含量仍高出34倍之多，但較Ⅱ組要低近1倍，至16h時幾乎接近了正常含量。兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內不同時間點之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，ET、DAO含量測定是判斷小腸通透性改變的敏感性指標。休克遷延時間越長，血中ET、DAO含量越高。羥乙基淀粉烏司他丁對于降低重度創傷-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有顯著性效果。

1 張育才，楊麗萍，湯定華，等.血管活性腸肽對大鼠內毒素性休克腸道損傷保護作用的研究.中華兒科雜志，2006，44（5）：369～373.

2 史繼德，康博雄，張代成，等.甲基強的松龍在失血性休克后的腸屏障功能障礙中對細胞間粘附分子-1的影響.蘭州大學學報，2006，32（1）：4～6.

3 Attuwaybi B，Kozar RA，Gates KS Moore-Olufemi S，et al.Hypertonic saline prevents inflammation，injury，and impaired intestinal transit after gut ischemia/reperfusion by inducing hemeoxygenase 1 enzyme.J Trauma，2004，56（4）：749～758.

4 Mikio Tomita，Maynko Nagira，Makoto Haga，et al. Clarification of the Mechanism of Structural Change Induced by Reoxyganation following the Induction of Lipid Pemxidation in Caco-2 Cell Monolayers.Drug Metab.Pharmacokinet，2002，17（1）：83～91.

5 Su Y，Wu S，Fan Y，et al.The preliminary experimental and clinical audy of the relationship between the pigment gallstone and internal mucosal barrier.J Gastroenterol Hepatol，2009，24（8）：1451～1456.

6 Venugopal BR， Ravishankar N， Rajamathi M. Interstratification of trioctahedral and dioctahedral smeetites through delamination and costacking. J Colloid Interfaee Sci，2008，324（1-2）：80～84.

7 Satin EL，Moore EE，Moore JB，et al.Systemic neutuophil priming by lipid mediators in post-shock mesenteric lymph exists agross species.J Trauma，2004，57（5）：950～952.

8 程光，李康生.大鼠重度創傷-失血性休克模型的建立.中華實驗外科雜志，2010，27（7）：888.

9 Jian Xing Chang，Shuang Chert，Li Ping Ma，et al. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock.World J Gaslroenterol， 2005，11（35）：5485～5491. 10 羅聲政，王瑞蘭.失血性休克與腸道屏障功能障礙.實用醫學雜志，2010， 26（3）：509～510.

11 周磊，張旭，楊清峰，等.感染后腸易激綜合征患者腸黏膜肥大細胞與細胞因子的相關性研究.中華全科醫學，2010，8（2）：201，259.

12 Moriguchi T，Hirasawa H，Oda S，et al.A patient with severe acute pancreatits successful treated with a new critical care procedure.Ther Apheresis，2002，6（3）：221～224.

13 Chiu C J，McArdle A H，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in low-flow states.Arch Surg，1970，101（4）：478～483.

14 Toft P，Andersen SK，Tonnesen EK.The systematic inflammatory response after major trauma.Ugeskr Laeger，2003，165（7）：669～672.

15 劉磊，王振杰. 活動性出血的失血性休克限制性液體復蘇的研究進展. 中華全科醫學，2011，1：114～116.

Objective To explore the effect of ulinastatin，hydroxyethyl starch on the protection of intestinal mucosal permeability.Methods Choose healthy male SD rats - 85 only normal control Group（divided into two groups at random，Ⅰ- Group，n=5），severe shock Group（Group～Ⅱ，n=40），Hydroxyethyl Starch and ΜLinastain for injection intervention severe shock to recovery Group（Group～Ⅲ，n=40），hind two groups and divided into fi ve time phase point，namely 1h，2h，4h，8h，16h，each time points，eight rats. Results Group III from recovery to begin DAO levels than group II nearly 1 times lower，and 8h II group reached its peak，and group III was falling rapidly. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The serum ET III group in 1H was normal in content is still as much as 34 times higher than in group II，but lower than the nearly 1 times，to 16h is close to a normal content. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. Conclusion Determination of the content of ET，DAO is to determine the sensitivity of intestinal permeability change index. The effects of hydroxyethyl starch it Ding to reduce severe traumatic hemorrhagic shock ET，DAO content in the blood of the rats after signifi cant effect.

2 amine oxidase Endotoxin Hydroxyethyl Starch ΜLinastain for Injection

063000 河北聯合大學附屬醫院