骨髓間充質干細胞缺血培養上清細胞因子分析

滕小梅　Md Abdur Rob Rayhan 劉廷興　沈振亞★

·實驗研究·

骨髓間充質干細胞缺血培養上清細胞因子分析

滕小梅Md Abdur Rob Rayhan 劉廷興沈振亞★

目的 研究骨髓間充質干細胞在缺血條件下分泌的細胞因子濃度變化。方法 用全骨髓差異貼壁法分離培養骨髓間充質干細胞（BMSCs），取第3代細胞進行實驗。實驗分兩組：A組提取正常培養細胞的上清液；B組將細胞置于無血清的培養基中24h后，提取上清液。采用蛋白分析技術檢測細胞培養上清液中27種細胞因子變化情況。結果 無血清細胞培養組中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的濃度與有血清的細胞培養組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 骨髓間充質干細胞在缺血條件下分泌的炎癥相關細胞因子發生變化。

骨髓間充質干細胞 缺血培養 細胞因子

骨髓間充質干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）改善心功能的研究已成為國際研究熱點，但細胞移植改善心臟功能的機制仍存在許多爭議，目前主要認為干細胞的旁分泌機制發揮主要作用，即骨髓間充質干細胞分泌大量細胞因子抑制細胞凋亡，促使心臟毛細血管生長，改善衰竭心肌血供，抑制炎癥反應，減輕心肌損傷。作者自2014年1月至7月分別應用有血清和無血清培養基培養MSC，研究其分泌的細胞因子差異，探討骨髓間充質干細胞在急性缺血環境下的旁分泌作用。

1　材料和方法

1.1材料 健康8周齡清潔級SD大鼠10只，均從中國科學院實驗動物中心購買，之后均按照GLP于蘇州大學心血管病研究所實驗室動物房進行喂養和觀察。低糖DMEM培養基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、QAR-CYT-3芯片（Raybiotech）。

1.2骨髓間充質干細胞（BMSCs）的培養及鑒定 通過全骨髓培養方法，當細胞培養至第三代時，流式細胞儀鑒定細胞表面分子CD29、CD90、CD73、CD11b的表達。

1.3MSC培養上清液中細胞因子分析 A組：收集第三代MSC在10%FBS的培養基的上清液，B組：收集第三代MSC在無血清培養基中24h后上清液，應用蛋白分析芯片QAR-CYT-3，按照Raybiotech公司的標準操作流程進行，檢測27種大鼠細胞因子：B7-2、b-NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、LIX、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNFα、VEGF。芯片結果采用GenePix4000B進行掃描，用軟件GenePix Pro 6.0讀取原始數據，使用標準分析軟件對數據進行處理，計算各樣品的濃度。

1.4統計學方法 統計采用SPSS17.0統計軟件分析。數據以表示，兩組間均數的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1骨髓間充質干細胞的培養及鑒定 P0代細胞在1～2d即開始有少量細胞貼壁，細胞形態不規則，多數呈現紡錘狀、多角形。P1代以后細胞生長迅速，2h后開始貼壁，細胞以集落生長的形式為主。細胞整體排列呈漩渦狀、輻射狀或魚群樣排列。取P3進行實驗，根據流式細胞儀檢測結果，顯示BMSCs超過90%表達CD29及CD90，但不表達造血干細胞表面標志CD34及CD4。

2.2MSC條件培養液中細胞因子的檢測 采用蛋白分析芯片法測定MSC在有血清和無血清條件培養下分泌的細胞因子，結果顯示無血清細胞培養組中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的濃度與有血清的細胞培養組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1，其它細胞因子濃度差異無統計學意義。

表1　兩組培養上清液中細胞因子的濃度［只，（x±s）］

3　討論

目前認為MSC主要通過分泌相關細胞因子在修復受損心肌中發揮旁分泌作用。MSC能夠分泌多種細胞因子，包括炎癥、造血、神經發育和血管再生等相關的細胞因子。MSC可分泌IL-6、IL-12、粒細胞集落刺激因子和干細胞因子［1，2］。MSC還能夠分泌腦源性神經營養因子和血管內皮生長因子［3］，分泌膠質源性神經營養因子和神經生長因子。而缺氧預處理可提高MSC的生存能力，缺氧損傷能夠激活多種細胞因子如血管內皮生長因子（VEGF）和間質源因子（SDF-1）等的分泌［4］。大量實驗證實體外缺氧缺血預處理骨髓間充質干細胞能更有效改善心功能。機制可能是骨髓間充質干細胞在缺血環境下通過分泌一些細胞發揮重要作用。本實驗將骨髓間充質干細胞置于無血清培養的體系中，分析其分泌的細胞因子變化，結果顯示：上清液中 ICAM-1、IFN-γ以及IL-10的濃度明顯降低。

ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成員，ICAM-1 在靜息的血管內皮細胞上呈低水平表達，通過與血管內皮細胞表面上的特異性受體結合而發揮其生物學活性［5、6］。IFN-γ可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。IL-10是由單核巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種細胞產生和具有多向性生物活性的強的免疫抑制因子，改變機體的免疫應答和MHCⅡ類抗原的表達，并介導Th1和Th2兩類T細胞之間的相互調節。IL-10抑制Th1介導的DTH反應，對臨床的器官移植、抗炎癥、抗寄生蟲病和某些傳染病的治療將有潛在應用前景。

1 Rafii S， Meeus S， Dias K， et al. Contribution of marrow-derived progenitors to vascular and cardiac regeneration. Semin Cell Dev Biol. 2002：13（1）：61～67.

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3 Kamei N，Tanaka N，Oishi Y et al. Bone marrow stromal cells promoting corticospinal axon growth through the release of humoral factors in organotypic cocultures in neonatal rats. Neurosurg Spine. 2007：6（5）：412～419.

4 Rosova I，Dao M，Capoccia B，et al.Hypoxic preconditioning resultsin in increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cells， 2008：26（8）：2173～2182.

5 宋宜慧，黃熙.細胞間黏附分子-1與血管生成的研究進展.免疫學雜志，2012，23（6）：530～533.

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Objective To study the secreted cytokine concentration changes of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in ischemic conditions. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured by adherent culture of whole bone marrow.The third generation of cells were used in this study. The experiments were divided into two groups：A. The supernatant wwas collected from normal cell culture. B. The supernatant was from cells in serum-free medium 24h. 27 kinds of cytokines in the supernatant were analyzed through the protein assay. Results Compared with the normal culture condition group，the concentration of ICAM-1，IFN- γ and IL-10 in the serum-free culture group were signifi cant decreased.（P＜0.05）. Conclusion There were changes in the infl ammation related cytokines secreted by bone marrow mesenchymal stem cells in the ischemic condition.

Bone marrow mesenchymal stem cells Ischemic conditions cytokines

蘇州市科技計劃項目資助（SYS201327）

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