COX-2在膽管癌中的表達(dá)及其選擇性抑制劑對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

楊博　馬亦龍★

COX-2在膽管癌中的表達(dá)及其選擇性抑制劑對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

楊博馬亦龍★

目的 評(píng)估環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939生長(zhǎng)和凋亡的影響。方法 通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COX-2蛋白在膽管癌標(biāo)本、膽管癌細(xì)胞株QBC939和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC中的表達(dá)水平；通過(guò)WST-1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；通過(guò)裸鼠荷瘤模型評(píng)估塞來(lái)昔布在體內(nèi)對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；通過(guò)凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)QBC939細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 COX-2蛋白在膽管癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，在QBC939細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于HIBEpiC細(xì)胞；塞來(lái)昔布在體內(nèi)和體外均可顯著抑制QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)；塞來(lái)昔布可誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論 COX-2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，該作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

膽管癌 環(huán)氧合酶-2抑制劑 凋亡

目前膽管癌缺乏標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的化療方案，眾多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證明常規(guī)化療方案對(duì)膽管癌的療效并不顯著［1］。環(huán)氧合酶-2（COX-2）是人體合成前列腺素（PG）的限速酶，COX-2與腫瘤的關(guān)系密切，其過(guò)表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］；而以COX-2為靶點(diǎn)的COX-2抑制劑可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)［3］。但目前關(guān)于COX-2與膽管癌之間的關(guān)系并未完全闡明。本研究主要檢測(cè)COX-2在膽管癌組織中的表達(dá)狀況，以探討COX-2抑制劑對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料 膽管癌細(xì)胞QBC939購(gòu)自中科院上海分院細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)；肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；BALB/C 裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；COX-2抑制劑塞來(lái)昔布購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司；細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗COX-2單克隆抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)圣克魯斯生物公司；羊抗鼠二抗購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)KPL公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Pierce公司。

1.2方法 （1）病例收集：收集本院2009年1月至2014年1月行膽管癌根治術(shù)標(biāo)本24例。所有標(biāo)本經(jīng)病理診斷證實(shí)均為膽管癌，并取相應(yīng)癌旁組織作為陰性對(duì)照組。所有患者均簽署手術(shù)同意書(shū)和病情告知書(shū)。（2）細(xì)胞培養(yǎng)： QBC939細(xì)胞和HIBEpiC細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。采用0.25%胰酶消化傳代。（3）western blot實(shí)驗(yàn)：采用western blot方法檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá)。首先提取細(xì)胞漿蛋白，取30μg蛋白樣品陸續(xù)完成變性、電泳、轉(zhuǎn)膜（0.2μmPVDF膜）、封閉、一抗孵育（1μg/ml）、二抗孵育（0.2～0.5μg/ ml）、ECL發(fā)光、顯影、定影等步驟。β-actin 蛋白作為內(nèi)參照。（4）動(dòng)物模型試驗(yàn)：21只雄性、年齡4周裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境下。將2×106個(gè)細(xì)胞注射于裸鼠的腋下。在接種2周后，可見(jiàn)米粒狀腫塊，成瘤率達(dá)90.5%（19/21）。分別予以高濃度塞來(lái)昔布［（50 mg/（kg·d）］、低濃度塞來(lái)昔布［（10mg/（kg·d）］進(jìn)行灌胃。隔天灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃28d。空白對(duì)照組采用等量等濃度生理鹽水灌胃。每周測(cè)量腫瘤體積V=L×W2/2（cm3）。第28天處死裸鼠，摘除荷瘤稱(chēng)重（g）。（5）WST-1法檢測(cè)QBC939細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 QBC939細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)目約為104，然后讓細(xì)胞貼壁過(guò)夜。在加入不同濃度塞來(lái)昔布（5、10、20、40、80μmol/L）處理72h后，各組細(xì)胞加入WST-1試劑，在37℃下孵育2h，然后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450nm波長(zhǎng)下的光密度值（OD）。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。（6）Annexin V-FITC雙染法檢測(cè)QBC939細(xì)胞凋亡：通過(guò)WST-1試驗(yàn)計(jì)算出塞來(lái)昔布的IC50值為29.97μmol/L，因而在本實(shí)驗(yàn)中采用該濃度進(jìn)行凋亡檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC939細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，在加入塞來(lái)昔布處理72h后，收集細(xì)胞≥1×105個(gè)，PBS沖洗后，分別先后加入FITC-Annexin V和PI染色液，在避光條件下孵育。然后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)均以表示。在三組數(shù)據(jù)組間比較時(shí)采用方差分析，兩組數(shù)據(jù)組間比較時(shí)采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1COX-2在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)COX-2蛋白在癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，其中COX-2蛋白在20例膽管癌標(biāo)本中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)正常組織（P＜0.05）（圖1A）。COX-2蛋白在QBC939細(xì)胞中的表達(dá)水平亦顯著高于HIBEpiC細(xì)胞（圖1B）。

圖1　COX-2蛋白在膽管癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2塞來(lái)昔布抑制QBC939細(xì)胞生長(zhǎng) 不同濃度塞來(lái)昔布作用72h后，QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。該抑制作用具有濃度依賴(lài)性，表現(xiàn)為藥物濃度越高對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)（P＜0.05）（圖2）。計(jì)算得出半數(shù)抑制濃度（IC50值）為29.97μmol/L。

2.3塞來(lái)昔布抑制裸鼠荷瘤生長(zhǎng) 采用塞來(lái)昔布灌胃后，在同一時(shí)間點(diǎn)裸鼠荷瘤體積顯著小于對(duì)照組，而高濃度藥物灌胃組荷瘤體積顯著低于低濃度藥物灌胃組（圖3A）。在藥物處理28d后，高濃度藥物灌胃組裸鼠荷瘤重量最小，低濃度藥物灌胃組裸鼠荷瘤重量次之，生理鹽水灌胃組裸鼠荷瘤重量最大（圖3B）。

2.4塞來(lái)昔布誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞凋亡 塞來(lái)昔布作用72h后，QBC939細(xì)胞的凋亡比例顯著增高，說(shuō)明塞來(lái)昔布能夠誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞發(fā)生凋亡。見(jiàn)圖4。

3　討論

以腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展相關(guān)分子作為治療靶點(diǎn)的分子靶向治療越來(lái)越受到重視。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白在多種消化道實(shí)體惡性腫瘤中如肝癌［4］、胃癌［5］、結(jié)腸癌［6］以及胰腺癌［7］中均存在表達(dá)異常升高的現(xiàn)象，且其高表達(dá)參與這些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。

圖2　塞來(lái)昔布抑制QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)

圖3　塞來(lái)昔布抑制裸鼠荷瘤生長(zhǎng)

圖4　塞來(lái)昔布誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞凋亡

COX-2蛋白在多數(shù)正常組織中表達(dá)微弱甚至缺失［8］，當(dāng)正常組織發(fā)生惡變時(shí)COX-2表達(dá)可受腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所產(chǎn)生的多種異常蛋白誘導(dǎo)而增高，例如炎性因子白介素-1［9］和白介素-8［10］、核因子KB （NF-KB）［11］，低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）［12］等。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)COX-2在膽管癌組織中表達(dá)異常升高，而在膽管正常上皮細(xì)胞中表達(dá)微弱，這與其他的研究發(fā)現(xiàn)基本相符。以上結(jié)果說(shuō)明COX-2異常升高可能在膽管癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用，也提示COX-2可能成為膽管癌治療中的靶點(diǎn)。于是，作者在體內(nèi)和體外研究中采用COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布作用于COX-2高表達(dá)的QBC939細(xì)胞，并觀察該細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡情況。

本資料顯示塞來(lái)昔布在體內(nèi)和體外均對(duì)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，且這種抑制作用具有明顯的濃度依賴(lài)性。通過(guò)計(jì)算得出塞來(lái)昔布對(duì)膽管癌細(xì)胞的IC50值約為29.97μmol/L。因此，在后續(xù)凋亡檢測(cè)試驗(yàn)中選用該濃度。另外塞來(lái)昔布能夠誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。細(xì)胞凋亡是一種由機(jī)體主動(dòng)調(diào)節(jié)、基因控制的程序性細(xì)胞死亡。凋亡根據(jù)信號(hào)途徑和參與基因不同，可分為內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，而參與基因根據(jù)其在凋亡過(guò)程中的作用不同可分為凋亡誘導(dǎo)基因和凋亡抑制基因，前者包括Fas，p53，bax等，后者包括bcl-2，bcl-xl等。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑能夠促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)基因的表達(dá)，同時(shí)降低凋亡抑制基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致凋亡［13，14］。這可能是塞來(lái)昔布導(dǎo)致QBC939細(xì)胞凋亡的原因。在本研究中未探討具體分子機(jī)制，有待于后續(xù)研究。

1 Rizvi S， Gores GJ. Pathogenesis， diagnosis， and management of cholangiocarcinoma. Gastroenterology，2013，145（6）：1215～1229.

2 Cheng J，F(xiàn)an XM.Role of cyclooxygenase-2 in gastric cancer development and progression.World J Gastroenterol，2013，19（42）：7361～7368.

3 Moon CM， Kwon JH， Kim JS， et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs suppress cancer stem cells via inhibiting PTGS2 （cyclooxygenase 2） and NOTCH/HES1 and activating PPARG in colorectal cancer.Int J Cancer， 2014，134（3）：519～529.

4 Bae SH，Jung ES，Park YM，et al.Expression of cyclooxygenase-2 （COX-2）in hepatocellular carcinoma and growth inhibition of hepatoma cell lines by a COX-2 inhibitor，NS-398.Clin Cancer Res，2001，7（5）： 1410～1408.

5 He XP， Shao Y， Li XL，et al. Downregulation of miR-101 in gastric cancer correlates with cyclooxygenase-2 overexpression and tumor growth. FEBS J，2012，279（22）：4201～4212.

6 Wendum D，Masliah J，Trugnan G，et al. Cyclooxygenase-2 and its role in colorectal cancer development. Virchows Arch，2004，445（4）：327～333.

7 Pomianowska E， Schj?lberg AR， Clausen OP， et al. COX-2 overexpression in resected pancreatic head adenocarcinomas correlates with favourable prognosis. BMC Cancer， 2014， 14（1）：458.

8 Chen WS，Wei SJ，Liu JM，et al.Tumor invasiveness and liver metastasis of colon cancer cells correlated with cyclooxygenase-2 （COX-2）expression and inhibited by a COX-2-selective inhibitor，etodolac.Int J Cancer， 2001，91（6）：894～899.

9 Huang ZF，Massey JB，Via DP.Differential regulation of cyclooxygenase-2（COX-2） mRNA stability by interleukin-1 beta （IL-1 beta） and tumor necrosis factor-alpha （TNF-alpha） in human in vitro differentiated macrophages.Biochem Pharmacol，2000，59（2）：187～194.

10 Manna SK1，Ramesh GT.Interleukin-8 induces nuclear transcription factor-kappaB through a TRAF6-dependent pathway.J Biol Chem，2005， 280（8）：7010～7021.

11 Choi YH，Jin GY，Li GZ，et al.Cornuside suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory mediators by inhibiting nuclear factor-kappa B activation in RAW 264.7 macrophages.Biol Pharm Bull，2011， 34（7）： 959～966.

12 He J，Wang M，Jiang Y，et al.Chronic arsenic exposure and angiogenesis in human bronchial epithelial cells via the ROS/miR-199a-5p/HIF-1α/COX-2 pathway.Environ Health Perspect，2014，122（3）：255～261.

13 Yang MY， Lee HT， Chen CM， et al. Celecoxib Suppresses the Phosphorylation of STAT3 Protein and Can Enhance the Radiosensitivity of Medulloblastoma-Derived Cancer Stem-Like Cells. Int J Mol Sci， 2014，15（6）：11013～11029.

14 周凱，徐建中，楊向東，等. 環(huán)氧化酶～2在嬰幼兒血管瘤中的表達(dá). 中華全科醫(yī)學(xué)，2014，7：1032～1034.

Objective To evaluate the effects of Celecoxib，a selective cyclooxygenase-2 inhibitor，on the proliferation and apoptosis of QBC939 cells. Methods The expression of COX-2 in the tissue samples，QBC939 cells and HIBEpiC cells was examined using western blot assay. The in vitro inhibitory effects of Celecoxib on the proliferation of QBC939 cells were tested using WST-1 assay. The in vivo inhibitory effects of Celecoxib on the proliferation of QBC939 cells were evaluated on animal xenograft tumor models. In addition，the effects of Celecoxib on apoptosis of QBC939 cells were evaluated using Annexin V-FITC assay. Results The level of COX-2 expression in cholangiocarcinoma tissues was signifi cantly higher than that in normal tissues and its expression in QBC939 cells was also signifi cantly higher than that in HIBEpiC cells. Celecoxib signifi cantly inhibited the proliferation of QBC939 cells in vitro and in vivo. In addition，Celecoxib induced apoptosis of QBC939 cells signifi cantly. Conclusion Celecoxib can induce signifi cant apoptosis on QBC939 cells which may lead to growth inhibition of QBC939 cells in vitro and in vivo.

Cholangiocarcinoma Cyclooxygenase-2 inhibitor Apoptosis

530021 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院介入治療科