液相色譜—串聯質譜法測定人血漿中氯吡格雷酸的濃度及意義

譚憶

摘要：目的：探討利用高效液相色譜-質譜聯用法進行人血漿中氯吡格雷酸濃度測定的臨床意義。方法：對血漿樣品進行測定，首先在樣品中加入內標物質美利曲辛，然后利用乙腈沉淀蛋白進行提取。并與健康男性受試者口服硫酸氫氯吡格雷受試制劑的血藥濃度進行生物等效性比較。結果：利用高效液相色譜-質譜聯用法測定人血漿中氯吡格雷酸，其回收率為97.2%-103.9%。結論：利用高效液相色譜-質譜聯用法對人血漿中的吡格雷酸的濃度進行測定，具有較高的靈敏度，適用于臨床上氯吡格雷片的藥代動力學研究。

關鍵詞： 氯吡格雷；高效液相色譜-質譜聯用法；藥代動力學

氯吡格雷是一種常用的抗血小板凝集及抗血栓藥物，其主要成分為噻吩并吡嗪類衍生物。這是一種經過口服可在人體內快速吸收的藥物，代謝速度較快，其在人體內的代謝產物主要是氯吡格雷酸[1]。氯吡格雷原型在人體內的濃度非常低，據相關文獻報道，實驗者在口服硫酸氫氯吡格雷75 mg 后對體內氯吡格雷酸的濃度進行測定，其在人體內地最大濃度（Cmax）僅為1010g[2]。國內外關于氯吡格雷血藥濃度測定的相關文獻較少，本文為了研究液相色譜-串聯質譜法對人血漿中氯吡格雷酸的濃度測定的意義，具體研究如下：

1 儀器與試劑

本次試驗選用的質譜儀為Agilent6410 型三重四極桿質譜儀，該類質譜儀配套有電噴霧離子源，另外選用的色譜儀為Agilent1200 型高效液相色譜儀。后期數據分析選用的軟件為美國安捷倫公司生產的Agilent Mass Hunter Quatitative Analysis 。另外還有相關的分析天平（萬分之一、FA2204N）、高速臺式冷凍離心機（Happy-TL16）以及MTN-2800W 型氮吹濃縮儀[3]。（試劑：硫酸氫氯吡格雷對照品：USP LOT G1K326乙腈、醋酸銨：Dikma Technology（色譜純）；甲醇：天津市科密歐化學儀器試劑有限公司（色譜純）[4]。

2 方法與結果

2.1 色譜/質譜條件：色譜柱為（ 4. 6 mm × 100 mm，2. 7 μm、Dikma），流動相為濃度0.4%甲酸。甲酸與乙腈的比例為30比70，色譜柱的溫度為30℃。進樣量設定為50 μl，所采用的離子源為電噴離子源。干燥氣流速度設定為12. 0 L /min，溫度設定為350 ℃，霧化器壓力為55 psig； 四極桿溫度為100 ℃； 毛細管電壓為4. 0 KV。

2.2溶液配制

對照品溶液：精密稱取硫酸氫氯吡格雷13.54mg（換算成氯吡格雷為10.25mg），于100ml的量瓶中溶解，定容，搖勻，備用，甲醇最終制成濃度為102.5 μg/ml的氯吡格雷儲備液。先后精密移取一定量的氯吡格雷儲備液進行稀釋，配制成一系不同濃度溶液，濃度先后為50. 4、151. 2、201. 6、1 008. 0、3 024. 0、4 032. 0、10 080. 0、30 240. 0、80 640. 0、1 00 800. 0 pg /ml。精密稱取地西泮對照品10. 04 mg（相當與10.03mg的地西泮）置于100ml的量瓶中進行溶解，定容，充分混勻，備用。此為內標溶液。最終濃度為100. 3 μg /ml 的地西泮，需要進行低溫保存，保存溫度為4 ℃。精密移取1.0ml的地西泮內標儲備液，置于50ml的量瓶中，定容，搖勻，此次選取的溶解液為甲醇–水（ 1∶ 1） 溶液，充分混勻，此為地西泮內標溶液Ⅱ，濃度為2. 0 060 μg /ml。精密量取上述配比所得內標溶液Ⅱ2. 5 ml，置于100ml量瓶中，定容，搖勻，進行第三次稀釋，所選取的稀釋液仍舊為甲醇–水（ 1∶ 1） 溶液，最終得到濃度50. 150 ng /ml 的內標溶液。

2.3血漿樣品的處理

對于采取的血漿樣品需要進行處理，首先需要量取空白血漿500μl，要進行精密量取。將空白血漿進行離心處理，血漿置于10ml的離心管，分別加入甲醇- 水（ 1∶ 1） 溶液、內標溶液、50 mmol /L 醋酸銨溶液，劑量分別為50μl、50μl以及500μl。將以上混合液進行渦旋混合，再加入3ml的甲基叔丁基醚，進行充分震蕩，時間8min左右，然后在5℃下進行離心，離心速度為1000轉/分鐘，時間6min。將有機層治愈離心管中，35℃水浴中進行吹干，大約留取200 μl 流動相溶液復溶，進行渦旋混合，精密稱取50 μl 樣本分析[5]。

2.4專屬性試驗：實驗顯示氯吡格雷和內標的保留時間分別為3. 7 和2. 7 min，說明血漿中的內源性物質不干擾氯吡格雷的測定。進行液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中氯吡格雷酸，其回收率為97.2%-103.9%。

2.5提取回收率實驗：需要精密量取氯吡格雷質控標準溶液以及內標溶液各50μl ，分別加入100μl流動相，進行充分混合，在混合均勻后提取50ul樣本作相應研究，每個濃度有6份樣本，得到未經提取的低、中、高3 個濃度的色譜峰面積（ 6 次測定的平均值） ，計算每一濃度提取后樣品（ 即精密度及準確度試驗樣品） 與未經提取樣品的色譜峰面積之比，得到的待測物和內標的提取回收率見表1，本方法待測物和內標的回收率均達到50% 以上，RSD小于15%，待測物低、中、高三個濃度的回收率相接近，內標回收率穩定，結果見表1。

表1提取回收率

2.6血漿樣品穩定性試驗：需要利用空白血漿制作血漿樣品，分別制作濃度為0.2以及15.0ng/ml的氯吡格雷血漿樣品，每個濃度的樣品需要有6份，6份樣品分別作不同的處理，第一份制成后立即處理分析；第二份需進行24h的放置，然后進行同等處理；第三份需要經過冷凍處理，在超低溫（-20℃）下放置24h，后經過室溫溶解，然后進行同等處理；第四份凍融兩次后在進行同等的處理，確定凍融的穩定性；第5份冷凍30d后進行處理，第六份冷凍60d后進行分析。實驗結果顯示，氯吡格雷血漿樣品有很好的穩定性，具體見表2

表二：血漿樣品穩定性

3討論

本文主要探討利用液相色譜-串聯質譜法進行人血漿中氯吡格雷酸濃度測定的臨床意義。液相色譜-串聯質譜法，以及乙醚提取處理法進行氯吡格雷酸濃度測定具有較高的靈敏度，其靈敏度為10 pg /ml。本次試驗在此基礎上，進行了實驗條件的優化，選取了新的提取溶劑--甲基叔丁基醚。這種溶劑可以在很大程度上減少實驗中的基質效應[6]，促進了實驗靈敏度的提升，是的靈敏度高達15pg /ml。本次試驗所選取的測定方法可以有效的對硫酸氫氯吡格雷的藥代動力學評價或生物等效性評價。

在實驗過程中，本文對多個流動相的配比情況進行了觀察與分析，分析中的乙腈比例會對實驗的結果產生較大影響，會影響氯吡格雷的保留時間。乙腈的比例高低與氯吡格雷的保留時間成反比，當乙腈濃度的降低，氯吡格雷的保留時間會延長[7]。試驗中選取0. 4%甲酸–乙腈（ 40 ∶ 60） 作為流動相進行分析，在此條件下進行觀察，氯吡格雷的保留時間較長，并且峰形較寬。實驗如果選取0. 4% 甲酸- 乙腈（ 25 ∶ 75） 作為流動相時，效果欠佳，因此流動相的選擇最終確定為0. 4%甲酸水溶液-乙腈（ 30 ∶ 70） 不但使氯吡格雷和內標物質得到很好的分離，同時也縮短了分析時間，有利于生物樣品的分析。

綜上所述：利用液相色譜-串聯質譜法對人血漿中的吡格雷酸的濃度進行測定，具有較高的靈敏度，是臨床上適用的氯吡格雷片的臨床藥代動力學研究的方法。

參考文獻：

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[2]陳敏純，李雪晴，賈艷艷，鹿成韜，宋穎，楊靜，丁莉坤，周倫，馮智軍，宋薇，文愛東.LC-MS/MS法測定人血漿氯吡格雷酸濃度及其生物等效性評價[J].中國新藥雜志，2012，22（24）：2924-2927+2935.

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