去腎交感神經(jīng)術(shù)對心肌梗死后犬心臟氧化應(yīng)激和交感神經(jīng)重構(gòu)的影響

宋立君，盧成志，李超，張瑾，王麗，馬藝杰

去腎交感神經(jīng)術(shù)對心肌梗死后犬心臟氧化應(yīng)激和交感神經(jīng)重構(gòu)的影響

宋立君1，盧成志2△，李超2，張瑾2，王麗2，馬藝杰3

目的觀察去腎交感神經(jīng)術(shù)（RDN）對犬心肌梗死（MI）后心臟氧化應(yīng)激和交感神經(jīng)重構(gòu)的影響。方法將18只健康犬隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組6只，只行冠脈造影檢查；心肌梗死組（MI組）6只，建立MI模型后1周行腎動脈造影檢查；心肌梗死+RDN治療組（MI+RDN組）6只，建立MI模型后1周行RDN治療。明膠海綿栓塞法制作MI模型后4周，通過超聲心動圖測量各組犬左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；免疫組化法檢測梗死周邊區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)纖維分布和密度；檢測心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)：超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果與假手術(shù)組相比，MI組和MI+RDN組LVEF和SOD降低（P＜0.05），LVEDV、LVESV、MDA和TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量均增加（P＜0.05）。TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量與SOD呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.818，P＜0.05），與MDA呈正相關(guān)（rs=0.900，P＜0.05）。MI+RDN組較MI組LVEF和SOD升高（P＜0.05），而LVEDV、LVESV、MDA和TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）。結(jié)論RDN可以降低心臟氧化應(yīng)激水平、抑制MI后心臟交感神經(jīng)重構(gòu)、改善心功能。

去腎交感神經(jīng)術(shù)；心肌梗死；交感神經(jīng)重構(gòu)；氧化應(yīng)激；動物，實(shí)驗(yàn)

急性心肌梗死中大約50%的心源性猝死患者是由于致命性室性心律失常所致，而心臟交感神經(jīng)重構(gòu)是室性心律失常和心源性猝死的重要原因［1］，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平增加有關(guān)［2-3］。近年來，大量研究顯示去腎交感神經(jīng)術(shù)（RDN）具有較好的降壓外治療作用，如減輕左室肥厚［4］、改善心功能［5］和內(nèi)皮功能［6］等。最近，Remo等［7］研究顯示RDN還可以降低室性心動過速的發(fā)生率，但其機(jī)制仍不明確。本研究旨在觀察RDN對心肌梗死（MI）犬交感神經(jīng)重構(gòu)的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料及分組健康成年雜種犬18只，雄性8只，雌性10只，體質(zhì)量15～18 kg，由天津春樂實(shí)驗(yàn)動物中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。18只犬隨機(jī)分為假手術(shù)組6只，只行冠狀動脈（冠脈）造影，不建立MI模型，1周后行腎動脈造影檢查；MI組6只，建立MI模型后1周只行腎動脈造影檢查；MI+RDN組6只，建立MI模型后1周行RDN。

1.2 MI模型建立參照文獻(xiàn)［8］方法，6%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈注射麻醉，根據(jù)犬反應(yīng)每30～60 min靜脈追加50 mg。氣管插管，機(jī)械通氣（GSM-Ⅱ麻醉呼吸機(jī)），于股動脈穿刺置入6F鞘管，肝素抗凝。行冠狀動脈造影，明確冠狀動脈解剖結(jié)構(gòu)，選擇前降支第一對角支遠(yuǎn)端為栓塞部位，經(jīng)微導(dǎo)管注射自制直徑約1 mm的明膠海綿栓塞顆粒，手術(shù)時間60～90 min。栓塞完成后10 min再次造影，靶血管呈“殘根樣”，確認(rèn)血流阻斷。拔除股動脈鞘管，無菌紗布壓迫止血后包扎。

1.3 去腎交感神經(jīng)術(shù)犬背部皮膚粘貼消融電極板。射頻消融儀（IBI-1500T，the United States IBI company）參數(shù)設(shè)定：溫度43℃，消融功率10 W，消融時間90 s。灌注泵設(shè)置：肝素化鹽水（5 000 U/500 mL）保持灌注量為2 mL/min；消融時灌注量為12 mL/min。股動脈穿刺并置入6F鞘管，通過6F JR4.0造影導(dǎo)管行雙側(cè)腎動脈造影，明確腎動脈位置及解剖結(jié)構(gòu)，撤出造影導(dǎo)管。經(jīng)動脈鞘將冷鹽水消融導(dǎo)管（6F，Syn?aptic Medical，China）送入腎動脈內(nèi)，通過導(dǎo)管尾端連接的三通閥注入造影劑以確定到達(dá)靶點(diǎn)位置。從腎動脈主干近端約二分之一段開始由遠(yuǎn)及近對兩側(cè)腎動脈沿軸向旋轉(zhuǎn)進(jìn)行3～4個位點(diǎn)消融。消融導(dǎo)管每到達(dá)一個新的消融靶點(diǎn)時，均先進(jìn)行一次造影，以明確導(dǎo)管與血管壁貼靠是否良好。手術(shù)完成后，再次對腎動脈進(jìn)行造影檢查。

1.4 超聲心動圖檢測MI后4周用飛利浦CX50行超聲心動圖檢查，犬全麻后仰臥位固定，采用常規(guī)超聲檢查方法，記錄左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV），應(yīng)用Simpson′s雙平面法測量左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。由2位檢測者獨(dú)立完成，取兩者測量平均值為最終測定結(jié)果。

1.5 心肌SOD、MDA水平測定MI模型建立后4周，處死實(shí)驗(yàn)犬，迅速取出心臟，并用冰生理鹽水洗凈，取左心室（游離壁和室間隔）梗死周邊區(qū)組織，用于檢測SOD、MDA。按1∶10制成10%勻漿，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清待測。采用黃嘌呤氧化酶（羥胺）法檢測SOD，采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)纖維檢測參照文獻(xiàn)［9］方法，采用免疫組織化學(xué)方法檢測心肌TH表達(dá)。取0.5 cm× 0.5 cm×0.1 cm心肌組織，磷酸鹽緩沖液沖洗，固定、包埋、切片。參照試劑盒提供的步驟進(jìn)行染色。選擇實(shí)驗(yàn)組、對照組陽性和陰性組織進(jìn)行×100和×400的顯微照相，圖像由計算機(jī)CMOS（OLYMPUS）及專用軟件（Image-Pro Plus）系統(tǒng)處理，計算積分光密度（IOD）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。3組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)犬存活情況MI組和MI+RDN組各有1只犬分別于MI后1 d、3 d死亡，假手術(shù)組無死亡。2.2MI后各組超聲心動圖檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較，MI組和MI+RDN組LVEDV和LVESV增高，LVEF降低。MI+RDN組較MI組LVEDV和LVESV降低，LVEF增高（均P＜0.05），見表1。

Tab.1Echocardiography analysis between three groups表1 3組超聲心動圖檢測結(jié)果

Tab.1Echocardiography analysis between three groups表1 3組超聲心動圖檢測結(jié)果

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與MI組比較，P＜0.05；表2同

LVEDV（mL）30.75±1.80 41.24±2.56a 36.96±3.52ab 21.66＊＊組別假手術(shù)組MI組MI+RDN組F n6 5 5 LVESV（mL）13.72±1.16 25.92±1.38a 21.51±1.85ab 98.37＊＊LVEF 0.55±0.03 0.37±0.03a 0.42±0.03ab 56.96＊＊

2.3 MI后各組梗死區(qū)心肌MDA、SOD含量的變化MI組和MI+RDN組較假手術(shù)組梗死周邊區(qū)心肌組織MDA含量升高，SOD含量降低；MI+RDN組較MI組MDA生成減少，SOD含量升高（P＜0.01），見表2。

Tab.2Comparison of MDA and SOD between three groups表2 3組MDA、SOD檢測結(jié)果比較

Tab.2Comparison of MDA and SOD between three groups表2 3組MDA、SOD檢測結(jié)果比較

組別假手術(shù)組MI組MI+RDN組F n6 5 5 MDA（μmol/g）1.92±0.37 3.67±0.59a2.65±0.30ab22.10＊＊SOD（U/mg）159.77±11.90 105.14±7.66a140.01±14.10ab30.79＊＊

2.4 各組TH水平的比較TH陽性神經(jīng)纖維形態(tài)、分布見圖1。MI后4周，假手術(shù)組、MI組、MI+RDN組TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量分別為66.82± 13.09、134.16±12.06及101.14±3.91，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.81，P＜0.01）。其中MI組、MI+RDN組均高于假手術(shù)組，而MI+RDN組較MI組降低（P＜0.01）。

2.5 SOD、MDA與TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量相關(guān)性分析TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量與SOD呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.818，P＜0.001），而與MDA呈正相關(guān)（rs=0.900，P＜0.001）。

Fig.1The distribution of TH positive staining nerve fibers（immunohistochemical，×400）圖1 各組心肌TH陽性神經(jīng)纖維分布（免疫組化，×400）

3 討論

急性心肌梗死時支配心臟的神經(jīng)會受到損傷，損傷的交感神經(jīng)發(fā)生Wallerian變性，造成周圍心肌失神經(jīng)支配。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）等在心肌或循環(huán)中的增加使神經(jīng)鞘細(xì)胞增生與軸突再生，受損的神經(jīng)發(fā)生重構(gòu)，這些新生神經(jīng)纖維以交感神經(jīng)纖維為主［10］。在MI早期，交感神經(jīng)適度再生是機(jī)體對于神經(jīng)組織損傷修復(fù)的正常反應(yīng)。但是，慢性期的神經(jīng)再生往往是不均一并且過度增生，可能導(dǎo)致神經(jīng)功能異常，對心肌的不應(yīng)期、自律性和傳導(dǎo)性產(chǎn)生影響，進(jìn)而增加區(qū)域間電生理的異質(zhì)性，從而增加惡性心律失常的發(fā)生率［11］。

研究顯示，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對交感神經(jīng)重構(gòu)具有重要影響，它們可以通過上調(diào)NGF受體表達(dá)和增加NGF合成使神經(jīng)過度增生［2-3］?；钚匝踝杂苫≧OS）是氧化應(yīng)激主要效應(yīng)分子，其生物學(xué)效應(yīng)受多種抗氧化酶調(diào)節(jié)。在心血管系統(tǒng)中，SOD［12］、過氧化氫酶［13］等是重要的抗氧化酶類。MDA是氧自由基與細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的一種小分子物質(zhì)，其生成量不僅反映氧自由基生成與否，還反映脂質(zhì)過氧化程度［14］。當(dāng)ROS的生成與抗氧化系統(tǒng)失衡時即導(dǎo)致氧化應(yīng)激。MI后釋放大量ROS造成心肌細(xì)胞損傷并導(dǎo)致支配心臟的神經(jīng)纖維重構(gòu)。此后，氧化損傷仍持續(xù)存在，導(dǎo)致心室重構(gòu)和心功能不斷惡化［15］。本研究顯示，MI后4周，與假手術(shù)組相比，MI組犬出現(xiàn)左心功能降低，心肌組織MDA水平增加，同時SOD水平降低，提示機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。MI+RDN組較MI組LVEDV和LVESV降低，LVEF增加，提示MI+RDN組左心功能有所改善，提示RDN可能在改善左室舒張功能方面作用更加明顯。此外，MI+RDN組較MI組心肌MDA降低，SOD增加，提示RDN降低了心肌氧化應(yīng)激水平。

TH是腎上腺素和去甲腎上腺素合成過程中的關(guān)鍵酶，為交感神經(jīng)特異性標(biāo)志物。Wang等［16］研究顯示，應(yīng)用β受體阻滯劑美托洛爾可以抑制MI后兔心臟交感神經(jīng)重構(gòu)。本研究顯示，MI后4周MI組TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量較假手術(shù)組增加，神經(jīng)纖維直徑粗大，形態(tài)和空間分布紊亂，表明MI后在神經(jīng)損害基礎(chǔ)上出現(xiàn)了交感神經(jīng)過度增生，加重了神經(jīng)支配的不均一性，且TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量與心肌氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)；與MI組比較，MI+RDN組TH陽性神經(jīng)纖維相對表達(dá)量減少，分布較均一，提示RDN具有抑制心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的作用，而這種作用可能與氧化應(yīng)激水平降低有關(guān)。

綜上所述，通過RDN選擇性阻斷中樞和外周交感神經(jīng)可以改善左心功能、降低心臟氧化應(yīng)激水平、抑制心臟交感神經(jīng)重構(gòu)。

［1］Huikuri HV，Castellanos A，Myerburg RJ.Sudden death due to car?diac arrhythmias［J］.N Engl J Med，2001，345（20）：1473-1482.

［2］Olivieri G，Otten U，Meier F，et al.Oxidative stress modulates tyro?sine kinase receptor A and p75 receptor（low-affinity nerve growth factor receptor）expression in SHSY5Y neuroblastoma cells［J］.Neu?rol Clin Neurophysiol，2002，2002（2）：2-10.

［3］Hasan W，Jama A，Donohue T，et al.Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarc?tion in rats［J］.Brain Res，2006，1124（1）：142-154.

［4］Brandt MC，Mahfoud F，Reda S，et al.Renal sympathetic denerva?tion reduces left ventricular hypertrophy and improves cardiac func?tion in patients with resistant hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59（10）：901-909.

［5］Davies JE，Manisty CH，Petraco R，et al.First-in-man safety evaluation of renal denervation for chronic systolic heart failure：primary outcome from REACH-Pilot study［J］.Int J Cardiol，2013，162（3）：189-192.

［6］Zhao B，Lu CZ，Zhang X，et al.Effect of renal sympathetic denerva?tion on endothelial function in hypertensive dogs［J］.Tianjin Med J，2012，40（10）：1037-1039.［趙斌，盧成志，張欣，等.去腎臟交感神經(jīng)術(shù)對犬高血壓及內(nèi)皮功能的研究［J］.天津醫(yī)藥，2012，40（10）：1037-1039］.

［7］Remo BF，Preminger M，Bradfield J，et al.Safety and efficacy of renal denervation as a novel treatment of ventricular tachycardia storm in patients with cardiomyopathy［J］.Heart Rhythm，2014，11（4）：541-546.

［8］Sakaguchi G，Sakakibara Y，Tambara K，et al.A pig model of chron?ic heart failure by intracoronary embolization with gelatin sponge［J］. Ann Thorac Surg，2003，75（6）：1942-1947.

［9］Lyu HS，Zhu QS，Wang J，et al.Processing Immunohistochemical Mi?crograph with Automatic Microscope and Image Analysis System［J］. CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALY?SIS，2004，9（1）：37-40.［呂宏升，朱慶生，王軍，等.全自動顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)處理免疫組化圖像［J］.中國體視學(xué)與圖像分析，2004，9（1）：37-40］.

［10］Nori SL，Gaudino M，Alessandrini F，et al.Immunohistochemical ev? idence for sympathetic denervation and reinnervation after necrotic injury in rat myocardium［J］.Cell Mol Biol（Noisy-le-grand），1995，41（6）：799-807.

［11］Cao JM，F(xiàn)ishbein MC，Han JB，et al.Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia［J］.Circulation，2000，101（16）：1960-1969.

［12］Fukai T，Ushio-Fukai M.Superoxide dismutases：role in redox sig?naling，vascular function，and diseases［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（6）：1583-1606.

［13］Goyal MM，Basak A.Human catalase：looking for complete identity［J］.Protein Cell，2010，1（10）：888-897.

［14］Janero DR.Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue inju?ry［J］.Free Radic Biol Med，1990，9（6）：515-540.

［15］Octavia Y，Brunner-La RHP，Moens AL.NADPH oxidase-depen?dent oxidative stress in the failing heart：From pathogenic roles to therapeutic approach［J］.Free Radic Biol Med，2012，52（2）：291-297.

［16］Wang Y，Liu J，Suo F，et al.Metoprolol-mediated amelioration of sympathetic nerve sprouting after myocardial infarction［J］.Cardiolo?gy，2013，126（1）：50-58.

（2014-12-17收稿2015-01-06修回）

（本文編輯陸榮展）

Effect of renal denervation on cardiac oxidative stress and sympathetic nerve remodeling after myocardial infarction in canine

SONG Lijun1，LU Chengzhi2△，LI Chao2，ZHANG Jin2，WANG Li2，MA Yijie3
1 Department of Gastroenterology of Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；2 Department of Cardiology of Tianjin First Center Hospital；3 First Center of Clinical College，Tianjin Medical University△

ObjectiveTo observe the effect of renal denervation（RDN）on the cardiac oxidative stress and sympathetic nerve remodeling after myocardial infarction（MI）in canine.MethodsCanine（n=18）were randomly divided into three groups：Sham operation group（SHAM group，n=6），MI group（n=6），MI+RDN group（n=6）.Anterior myocardial infarction was gained by gelatin sponge embolization of the left anterior descending artery.At four weeks post-MI，left ventricular enddiastolic volume（LVEDV），left ventricular end-systolic volume（LVESV）and left ventricular ejection fraction（LVEF）were examined using echocardiography.Immunohistochemical assay was used to analyze the distribution and density of tyrosine hydroxylase（TH）stained nerve fibers at peri-infarct zone.Myocardial superoxide dismutase（SOD）activity and malondialde?hyde（MDA）were also assessed.ResultsCompared with dogs in SHAM group，LVEF and SOD expression were decreased in MI group and MI+RDN group（P＜0.05），but Left ventricular end diastolic pressure（LVEDP），LVEDV，LVESV，MDA and rate of TH positive staining nerve fibers were increased（P＜0.05）.There was a negative correlation between the rate of TH positive staining nerve fibers and SOD level（rs=-0.818，P＜0.05）and a positive correlation between rate of TH positive stain?ing nerve fibers with MDA level（rs=0.900，P＜0.05）.By contract，compared with MI group，LVEF and SOD in MI+RDN group were increased（P＜0.05），while LVEDV，LVESV，MDA and rate of TH positive staining nerve fibers were significant?ly lowered（P＜0.05）.ConclusionRDN is effective to decrease the level of cardiac oxidative stress and improve cardiac sympathetic nerve remodeling and heart function after myocardial infarction in canine.

renal denervation；myocardial infarction；sympathetic nerve remodeling；oxidative stress；animals，laboratory

R542.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.009

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（14JCYBJC26100）；天津市衛(wèi)生局科技基金（2014KY11）

1天津市第一中心醫(yī)院消化科（郵編300192），2心內(nèi)科；3天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院

宋立君（1985），男，碩士，主要從事高血壓病基礎(chǔ)和臨床研究

△通訊作者E-mail：lucz8@126.com