β3－腎上腺素能受體對心室重塑大鼠鈣調磷酸神經酶信號通路的調節及益氣溫陽活血方的干預作用

楊冬花 顧廣富 羅建華

（1.貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫學院2011級研究生，貴州 貴陽 550002）

研究［1］發現，β3－腎上腺素能受體（β3－AR）對心肌細胞Ca2＋的調控可能是其在衰竭心臟發揮作用的重要機制，鈣調磷酸神經酶（CaN）作為細胞內Ca2＋敏感的信號物質，在心室重塑的發展中起重要作用［2］。前期工作發現益氣溫陽活血方通過影響心力衰竭大鼠血漿尾加壓素Ⅱ、內皮素－1和腎上腺髓質素水平，防止心室重塑，改善心臟功能［3］，但是否通過β3－AR 調節CaN 信號通路抑制心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過觀察β3－AR 對心室重塑大鼠CaN 信號通路的調節及益氣溫陽活血方的干預研究，為進一步臨床運用提供理論依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料（1）實驗動物：健康Wistar雄性大鼠40只，清潔級，鼠齡5～6個月，體質量（250±10）g，由貴陽醫學院實驗動物學部提供，合格證號：SYSK（黔）2002－0001。（2）益氣溫陽活血方主要成分：人參、黃芪、丹參、益母草各30g，白術、茯苓各15g，桂枝9g等11味中藥。藥材予貴州省人民醫院中藥房一次性選購，煎藥濾渣取汁在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4g，保存備用。

1.2 試劑 ISO（Sigma公司），卡維地洛（齊魯制藥有限公司，批號：H20000100），Trizol（Invitroge公司），引物由上海生物工程公司合成，大鼠抗人β3－AR 抗體（Abcam 公司），兔抗人CaN 抗體及兔 抗 人NFAT3抗體（Santa Crus公司），NFAT3核蛋白提取 試劑盒（EPIGENTEK組公組司），NFAT3組核組蛋組白組活性檢測試劑盒（Active Motif公司），ECL 顯影試劑盒（Santa Cruz公司）。

1.3 方法（1）心力衰竭的模型制備［4］：采用異丙腎上腺素腹腔注射［3mg／（kg·d）］誘導慢性心力衰竭模型。（2）動物分組及治療：選用Wistar雄性大鼠，隨機分為正常組、模型組、中藥組（益氣溫陽活血方治療組）、西藥組（卡維地洛治療組），每組10只，實驗開始中藥組和西藥組分別予益氣溫陽活血方（8mL／kg）和卡維地洛［50mg／（kg·8mL）蒸餾水］灌胃治療，每日2次。正常組及對照組以蒸餾水等量灌胃，共8周。試驗結束后麻醉測量心臟結構和功能，抽取血漿，然后處死動物，留取心臟組織，置于－70 ℃低溫冰箱中冷凍保存，以檢測其他指標。（3）心臟結構及功能測定：對各組大鼠實驗結束后以Agilent SONOS 5500超聲儀對大鼠行超聲心動圖檢查。分別測量左室舒張末期內徑（LVDd）、左室收縮末期內經（LVDs）、左室后壁厚度（LVPW）、室間隔厚度（IVS），推算射血分數（EF%值）。EF%=（LVDd－LVDs）／左室舒張末內徑×100%。（4）心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3mRNA 的表達：β3－AR（444bp）上游5′－AGTGGG ACTCCTCGTAATG－3′，下 游5′－CGCTTAGCTACGACGAAC－3′。CaN（339 bp）：上 游5′CTTTCAACCAC CTCTTCGG 3′，下游5′GCTCCATCAGCTTCA CTACCTGTCC 3′；NFAT3組引組物（382組bp）：sense：5′CTACAGCAGCGTCCAGAGC 3′，antisense：5′TAGCCAACAACACCCCCACTCCCAC 3′。GAPDH（187 bp）：上 游5′－GACAACGGCTCCGGCATGTG－3′，下游5′－TGAGGATGCCTCTCTTGC－3′。按Trizol試劑說明書提取左室心肌組織總RNA，參照第一鏈cDNA 合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應，然后進行PCR反應。取PCR產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度（A）值，以目的基因與GAPDH 條帶的吸光度（A）值的比值代表其表達的相對量。（5）心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3蛋白質的表達：提取左心室組織蛋白質，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉膜。一抗濃度均為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，化學發光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統進行密度掃描并分析。（6）NFAT3核蛋白活性檢測 無菌條件下取左心室肌組織，碾磨勻漿以備提取核蛋白，核蛋白提取實驗步驟及核因子活性實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心臟結構及功能的測定 與正常組比較，模型組大鼠心臟IVS 及LVPW 厚度均增厚，差異有統計學意義（P＜0.05）；而EF%值與正常組比較，模型組大鼠則明顯降低（P＜0.05）。中藥組、西藥組大鼠IVS、LVPW 及EF%值與正常組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組心臟結構及功能的檢測（±s）

表1 各組心臟結構及功能的檢測（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

2.2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA的表達水平檢測 模型組大鼠心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。中藥組、西藥組心肌組織β3－AR、CaN及NFAT3mRNA 的表達水平與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平（±s）

表2 各組心肌組織β3－AR、CaN 及NFAT3mRNA 的表達水平（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

2.3 各組心肌組織β3－AR、CaN 和NFAT3蛋白質的表達水平及NFAT3 核蛋白活性檢測 模型組大鼠心肌組織β3－AR、CaN 和NFAT3蛋白質的表達水平及NFAT3 核蛋白活性與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。中藥組、西藥組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質的表達水平及NFAT3 核蛋白活性與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質的表達水平及NFAT3 核蛋白活性（±s）

表3 各組心肌組織β3－AR、CaN、NFAT3蛋白質的表達水平及NFAT3 核蛋白活性（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3 討論

β3－AR 是繼β1－AR、β2－AR 后發現的又一β腎上腺素受體，在心力衰竭時隨兒茶酚胺濃度升高、去甲腎上腺素的釋放，β3－AR 被激活，β3－AR 持續增多將引起放大效應，產生持續的負性肌力作用，導致進一步心室重構，惡化心功能［5］。

Ca2＋是心肌細胞最重要的第二信使，當心肌細胞受到機械牽張、負荷增加或神經體液因素的刺激時，胞內Ca2＋濃度出現反應性增加，進而通過調節下游因子誘導心室重塑的發生發展［6］。β3－AR 對心肌細胞Ca2＋的調控可能是其在心室重構中發揮作用的重要機制。

CaN 受Ca2＋信號調控而發揮多種生物功能，而CaN 自身不但是多條信號傳導通路的中心環節，而且還可通過去磷酸化作用使Ca2＋信號和其他調節機制偶聯起來，進而對其他信號通路進行調節，是細胞在信號調控與信號傳遞中的效應酶和調節酶［7］。NFAT3核蛋白活性依賴于胞漿中鈣離子轉運至細胞核內的流量，胞漿內鈣離子的增加激活鈣調蛋白，進而激活鈣調神經磷酸酶，使胞質中的NFAT3去磷酸化進入細胞核，NFAT3核蛋白活性增加，調節下游心肌肥大相關基因，如腫瘤壞死因子α、內皮素－1、血管緊張素Ⅱ等的表達促進心室重塑［8］。

本研究結果顯示，以異丙腎上腺素造模后，模型大鼠出現LVPW 及腦明顯增厚，而EF%值下降。上述慢性心衰大鼠的相關數據與人的慢性心力衰竭心室重塑出現心肌收縮力下降、心室肥厚的相似，提示造模成功。而且模型大鼠在出現LVPW 及IVS明顯增厚、EF%值下降的同時，伴隨β3－AR、CaN、NFAT3mRNA 和蛋白質的表達水平以及NFAT3核蛋白活性明顯升高。我們推測，心力衰竭時交感－腎上腺髓質系統激活，β3－AR 持續興奮，導致心肌細胞［Ca2＋］i增加，而心肌細胞［Ca2＋］i增加，激活CaN 使NFAT3去磷酸化并進入胞核，NFAT3核蛋白活性增加，活化下游多種心肌肥厚的相關基因。提示β3－AR 可通過調控CaN－NFAT3信號轉導通路參與調節慢性心力衰竭心室重塑的病理生理過程。

卡維地洛是一種具有多種附加作用的第三代β受體阻滯藥，是非選擇性地阻滯β受體及選擇性地阻滯α1受體，大規模臨床實驗證實可抑制慢性心力衰竭心室重塑。本研究結果顯示，益氣溫陽活血方與卡維地洛一樣，可以抑制β3－AR、CaN、NFAT3 mRNA 和蛋白質的表達水平以及NFAT3 核蛋白活性，改善心力衰竭大鼠心臟功能，提高EF%值逆轉IVS及LVPW 厚度，防止心室重塑。故初步推論心力衰竭時，益氣溫陽活血方通過抑制心臟的局部RAAS 系統，阻斷心力衰竭時過分激活的β3－AR，從而抑制CaN 信號通路逆轉心室重塑，具體作用機制有待于進一步研究證實。

［1］鄧義軍，伍衛，方昶，等.β3－腎上腺素能受體對心力衰竭大鼠心室肌細胞內靜息Ca2＋濃度的調控及其轉導途徑［J］.南方醫科大學學報，2009，29（8）：1635－1640.

［2］王術芳，王曉麗.鈣調神經磷酸酶與心肌肥厚的研究現狀［J］.中國老年學雜志，2013，33（5）：1235－1237.

［3］楊冬花，付蓉，羅建華，等.心力衰竭大鼠不同時期尾加壓素Ⅱ、內皮素－1和腎上腺髓質素水平變化及益氣溫陽活血方對其影響的研究［J］.貴州醫藥，2012，36（1）：4－7.

［4］劉艷麗，劉奔，屈揚揚，等.氧化應激和鈣／鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ參與β腎上腺素受體持久激動引起的大鼠心肌肥厚［J］.生理學報，2013，65（1）：1－7.

［5］安慧玲，楊君，陳枚潔，等.β3 腎上腺素能受體應用的研究進展［J］.醫學綜述，2013，19（19）：3470－3474.

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［7］Ding W，Dong M，Deng J，et al.Polydatin attenuates cardiac hypertrophy through modulation of cardiac Ca2＋handling and calcineurin－NFAT signaling pathway［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，307（5）：H792－802.

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