貝那普利聯合低分子肝素對大鼠腎纖維化的作用研究

盧濤 朱春玲

（1.海口市人民醫院腎內科，海南 海口 570000；2.貴陽醫學院附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550004）

腎間質纖維化是指在各種致病因子作用下，間質細胞及細胞基質蛋白合成增加，降解受抑制造成細胞外基質（ECM）的大量堆積導致的［1］。低分子肝素（LMWH）具有抑制腎小球系膜細胞和基質增生的作用及抗腎間質纖維化作用［1］。本文通過觀察聯用貝那普利和LMWH 與單用貝那普利對轉化生長因子－β1（TGF－β1）、基質金屬蛋白酶－2（MMP－2）的表達和對腎組織結構的影響，以探討藥物對腎間質纖維化的作用效果，并為臨床治療提供更多的理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗組動組物組雄組性SD組大組鼠72組只，2組個組月組齡組左右，體質量150～200g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 鹽酸貝那普利片（商品名洛丁新，成都地奧制藥集團有限公司，批號070501），低分子肝素鈣注射液（商品名尤尼舒，海南通用同盟藥業有限公司，批號20060401，國藥準字H20010300）。以下試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠TGF－β1（編號BA0290），兔抗鼠MMP－2（編號BA2200），生物素標記羊抗兔IgG（編號BA1003），鏈酶親和素－過氧化物酶復合物（編號SA1082），封閉用正常山羊血清（編號AR0009），DAB顯色劑（編號AR1022）。

1.3 動物造模 左側行單側輸尿管結扎術（UUO），建立UUO 模型。假手術組打開腹腔后即關閉腹腔。

1.4 分組 健康SD 大鼠72只，預養1周后，空腹12h，隨機分為4組：假手術組、模型組、貝那普利組、貝那普利＋LMWH組，每組18只。貝那普利組術后給予貝那普利10 mg／（kg·d）灌胃，貝那普利＋LMWH組給予貝那普利10 mg／（kg·d）灌胃及LMWH 200IU／（kg·d）皮下注射。

1.5 標本采集 乙醚麻醉后，腹部作縱形切口，分離出左腎，用生理鹽水反復灌洗至發白，摘除腎臟，剔除包膜，橫斷切取約0.5cm 柱狀體2 塊，置于4%多聚甲醛中固定12h，石蠟包埋，切片。HE 染色：常規制片觀察。Masson 染色：常規制片觀察。免疫組化：采用SABC法，常規制片觀察。

1.6 腎小管間質損傷評分 在低倍鏡下（×200）依序單盲法觀察左上、右上、左下、右下、中間5個腎間質視野，按腎小管間質損傷評分標準評分并計算各個評分的均值，得出腎小管間質損傷指數。

1.7 免疫組化 TGF－β1 及MMP－2：細胞胞漿染上棕黃色為陽性細胞。在400倍光鏡（LEICA DM 1000）下目測5個病變比較明顯的視野并計數陽性細胞總數，結果以陽性細胞數／HP×400表示。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料采用方差分析，數據用（±s）表示，多組間用單因數方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 假手術組：體質量穩定，精神狀況良好；模型組：精神逐漸萎靡、消瘦；貝那普利組及貝那普利＋LMWH組：懶動，體質量稍減輕。

2.2 Masson 染色結果 假手術組：腎小管結構正常；模型組：術后5d，小管間質輕度增寬，少量炎性細胞浸潤及膠原沉積；術后10d，小管間質中度增寬，小管結構破壞，偶有管腔塌陷，炎性細胞浸潤，膠原成分增加；術后15d，小管間質損傷程度明顯，3個時段比較差異有統計學意義（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較同期模型組腎小管間質損傷指數減低（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組腎小管間質損傷指數減低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質損傷指數

2.3 TGF－β1 在各組的表達水平 假手術組水平最低，模型組水平最高（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較模型組表達水平低（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較貝那普利組表達水平低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎小管間質TGF－β1的表達

2.4 MMP－2的表達水平 假手術組水平最高，模型組水平最低（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較模型組水平高（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較貝那普利組水平高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎小管間質MMP－2的表達

3 討論

腎間質纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發展到后期的病理學特征，是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎功能衰竭的共同通路。腎間質纖維化病變過程涉及細胞、細胞因子、ECM、生長因子及它們之間的相互作用［1］。在組調組節組因組子組中，TGF－β1組被組公組認組為是最主要的前纖維化因子［2］。作為一種強效的致纖維化因子，TGF－β1在腎間質纖維化發生、發展的多個環節起作用。ECM 在腎間質的過度沉積是引起腎間質纖維化的主要原因，ECM 的降解由細胞外基質降解酶系統介導，其中基質金屬蛋白酶／基質金屬蛋白酶抑制物（MMPs／TIMPs）的表達與活性異常在其中發揮重要的作用。許多腎臟疾病可以激活腎局部腎素－血管緊張素系統使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）分泌增多，進而導致腎間質纖維化。用ACEI能抑制Ang Ⅱ引起的腎臟纖維化及炎癥反應，對腎臟具有較好的保護作用［3－4］。本實驗中模型組Masson染色顯示間質膠原沉積加重，腎小管間質損傷指數升高，提示UUO 造模成功。模型組TGF－β1 表達漸增強而MMP－2表達漸減少。實驗顯示貝那普利組較同期模型組腎間質損傷指數低，差異均有統計學意義（P＜0.05），證實貝那普利有延緩腎間質纖維化的作用。貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組腎間質損傷指數減低（P＜0.05），提示在貝那普利使用的基礎上加用LMWH 會進一步減輕腎間質纖維化。關于在貝那普利使用的基礎上加用LMWH 會進一步改善腎間質纖維化的機制，有研究［5］顯示肝素通過抑制TGF－β1啟動子和防止核蛋白與調節 性AP－1 位 點組結組合，從組而組抑組制TGF－β1組表達。并且肝素可以促進內皮細胞表達細胞外基質降解酶t－PA 活性，促進細胞外基質金屬蛋白酶的表達，從而促進ECM 的降解［6］。本實驗顯示貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組的TGF－β1表達水平減低、MMP－2表達水平升高（P＜0.05），提示在貝那普利使用的基礎上加用LMWH 改善腎間質纖維化的機制之一可能與LMWH組對UUO組模型中TGF－β1、MMP－2組的組表組達組水組平組的組調組節組有組關。關組于LMWH組對UUO組模型組中TGF－β1、MMP－2組具組體組調節機制有待進一步研究。

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