ShRNA靶向干擾BHRF1基因抑制鼻咽癌細胞增殖

ShRNA靶向干擾BHRF1基因抑制鼻咽癌細胞增殖

張艷平丁矢李雪蘭楊杰唐峰歐勇

(常德職業技術學院醫學系，湖南常德415100)

摘要〔〕目的針對ShRNA靶向干擾BHRF1基因抑制鼻咽癌細胞增殖以分析癌癥靶向治療的前景。方法通過基因測序法鑒定所構建的siRNA表達載體。用四唑鹽比色(MTT)法、流式細胞術評價轉染siRNA后對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響。結果與NC-shRNA組相比，BHRF1-shRNA組細胞凋亡增加，凋亡率為(31.51±1.59)%。結論由慢病毒載體介導的shRNA表達載體進入細胞后，可以有效下調BHRF1基因表達水平，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

關鍵詞〔〕慢病毒；ShRNA；靶向干擾；BHRF1基因；細胞增殖

中圖分類號〔〕R739.63〔

基金項目：2012年度湖南省高等學?？茖W研究項目(12C0968)

通訊作者：丁矢(1979-)，女，講師，主要從事病理學研究。

第一作者：張艷平(1971-)，女，副教授，主要從事醫學免疫學與病原學研究。

目前認為鼻咽癌的發生、發展與遺傳、環境和Epstein-Barr(EB)病毒感染等多因素有關，特別是與EB病毒(EBV)密切相關〔1〕。該疾病好發于中老年人群，具有較高的致殘、致死率。EBV早期基因BamHI-H右向讀碼框1(BHRF1)基因編碼的BHRF1蛋白是一種結構與功能都和細胞Bcl-2 同源的蛋白，很多研究〔2，3〕表明BHRF1 在EBV復制期可以抑制感染細胞的凋亡，延長細胞壽命，有利于病毒的成熟和擴散，但BHRF1基因編碼的蛋白最終是通過何種途徑抑制細胞凋亡的發生，從而導致細胞癌變的分子機制目前還未完全闡明。鑒于EBV BHRF1 基因與原癌基因bcl-2 同源，具有抑制細胞凋亡的作用，探討以BHRF1 為靶點對EBV 相關鼻咽癌進行治療的巨大潛在價值。

1資料與方法

1.1一般資料我院2010年1月至2013年12月老年鼻咽癌手術患者20例，男13例，女7例；平均年齡(65.32±3.78)歲，術中病理切片，并分離出人鼻咽癌CNE2細胞，將這些細胞分為兩組，一組為BHRF1 shRNA質粒載體轉染過的CNE2細胞(BHRF1-shRNA組)，一組為未進行轉染的CNE2細胞(NC-shRNA組)。Trizol totalRNA試劑盒，BHRF1 shRNA序列，由Qiagen公司合成，構建靶向表達載體，應用體外轉染試劑轉染CNE2細胞。

1.2方法運用四唑鹽比色(MTT)法繪制生長曲線。選擇對數生長期細胞0.25%胰酶消化，懸浮計數，接種于96孔板，約500個/孔。慢病毒感染后置于37℃、5% CO2培養箱孵育10 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液，繼續細胞培養箱內培養4 h。移除培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min，酶聯免疫檢測儀。570 nm處測量每孔吸光值光密度(OD)值，OD值表示細胞增殖能力大小。連續觀察7 d繪制細胞生長曲線。同時設置調零孔(培養基、MTT、DMSO)，空白對照孔，每個樣本設3個復孔。

運用異硫氰酸熒光素(FITC)-Annexin V/碘化丙啶(PI)雙染色法測定細胞凋亡。按FITC-Annexin V/PI試劑盒操作說明，取不同時間點細胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集1×105～5×105細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞二次，1 000 r/min，離心5 min。加入500 μl的結合緩沖液，輕輕搖晃或者吹打，使細胞懸浮，先加入5 μl Annexin V-增強綠色熒光蛋白(EGFP)混勻后，再加入相同體積 Propidium Iodide混勻。在室溫下，避光環境中，反應5～15 min。1 h內，進行流式細胞儀上樣檢測，激發波長Ex=488 nm；發射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP 的綠色熒光通過FITC 通道(FL1)檢測；PI 紅色熒光通過PI 通道(FL2 或FL3)檢測。熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。以β-actin為內參，運用Western印跡法分析各感染組BHRF1基因蛋白表達情況，獲得各組BHRF1基因表達量，以相同觀察時間點空白組細胞BHRF1基因表達量為100%，利用公式：BHRF1表達率(%)=100%×(BHRF1-shRNA組或NC-shRNA組BHRF1基因蛋白表達量/空白組hTERT 表達量)，計算各組細胞中BHRF1基因蛋白相對表達水平。酶標儀分析各組細胞，在570 nm處測量每孔吸光值OD，以空白組細胞OD值為100%，通過公式：100%×(處理組OD值/空白組OD值)。流式細胞分析選擇感染后48 h作為觀察時間點，流式細胞圖中，右下象限(FITC+/PI-)為早期凋亡細胞，而右上象限(FITC+/PI+)是晚期凋亡細胞，凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3統計學分析采用SPSS13.0軟件進行成組t檢驗。

2結果

2.1轉染后BHRF1基因蛋白表達情況空載體組與NC-shRNA組比較，感染后0、24、48、72 h，BHRF1表達量無改變(P值均>0.05)；BHRF1-shRNA組與NC-shRNA組比較，感染后0 h，BHRF1蛋白表達量無改變(P>0.05)，感染后24、48、72 h，BHRF1表達量明顯降低(P值均<0.05)。BHRF1-shRNA組表現明顯時間依賴性，隨著觀察時間的延長，后一個觀察時間點都較前一個觀察時間點細胞中BHRF1表達量出現明顯下降。見表1。

2.2MTT繪制生長曲線空載體組與NC-shRNA組比較，轉染細胞后1～7 d，細胞增殖出現減慢趨勢，但無統計學意義(P值均>0.05)。BHRF1-shRNA組與NC-shRNA組比較，感染后1 d就出現了增殖減慢趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，2 d后，增殖減慢作用逐漸增強(P值均<0.05)。見表2。

2.3流式細胞檢測BHRF1-shRNA對細胞凋亡的影響空載體組與NC-shRNA組凋亡率(9.68%±1.50% vs 10.53%±1.43%)差異不顯著(P>0.05)。BHRF1-shRNA組(31.51%±1.59%)與NC-shRNA組、空載體組比較，凋亡作用明顯增加(P<0.05)。

組別0h24h48h72h空載體組95.64±4.9096.58±3.7496.38±2.7494.59±4.52NC-shRNA組96.88±3.1396.32±2.5596.73±4.1897.46±2.14BHRF1-shRNA組96.02±2.8477.72±4.511)2)3)62.01±3.491)2)4)44.26±3.301)2)5)

與空載體組比較：1)P<0.05；與NC-shRNA組比較：2)P<0.05；與0 h比較：3)P<0.05；與24 h比較：4)P<0.05；與48 h比較：5)P<0.05；下表同

組別1d2d3d4d5d6d7d空載體組89.78±8.0583.72±9.8188.35±9.3587.26±7.9589.14±7.9788.57±6.8590.28±5.60NC-shRNA組87.16±9.2187.68±6.8588.14±9.2686.01±8.1587.16±7.8487.90±7.7188.01±8.62BHRF1-shRNA組82.58±9.2170.02±6.941)2)56.39±5.401)2)50.32±5.881)2)58.38±5.711)2)56.33±4.231)2)59.97±5.451)2)

3討論

已有研究〔4〕以端粒酶為研究切入點，試圖探索鼻咽癌新的治療靶點和新的治療模式。端粒酶與鼻咽癌發生發展的密切聯系已被許多研究學者證實。范才文等〔5〕使用端粒重復序列擴增法(TRAP)測定了136例原發性鼻咽癌的手術切除標本中端粒酶的活性，其中癌組織中端粒酶的活性陽性率為80.1%，而鄰近正常組織標本4.4%；其中小細胞鼻咽癌(SCLC)100%〔6〕。劉瑾等〔7〕首次運用meta分析結果顯示，端粒酶活性陽性(標本來源于肺)者患鼻咽癌的危險性是端粒酶陰性者的66.43倍；端粒酶陽性在鼻咽癌人群中出現的概率是非鼻咽癌人群的12.13倍；端粒酶陰性在鼻咽癌人群中出現的概率僅為非鼻咽癌人群的0.22倍〔7〕。Meta分析結果顯示端粒酶是一種高靈敏度和特異度的腫瘤標志物〔8〕。

無論是采用何種方式制備shRNA，都需要考慮如何將shRNA高效地導入靶細胞，采用何種基因導入系統是基因治療的關鍵，這決定進入靶細胞的基因量，影響基因治療效果。雖然可以將體外化學合成的siRNA利用陽離子脂質體陽離子脂質體(如LipofectamineTM2000)直接轉染細胞，并能特異性抑制哺乳動物細胞內同源基因的表達。但雙鏈siRNA是帶負電的聚合物，難以直接通過疏水性的細胞膜〔9，10〕。且shRNA分子易被RNA酶降解。為了解決這些難題，而又不影響shRNA的生物活性，目前常采用的方法是將shRNA序列插入到質粒中，構建shRNA穩定表達載體，然后包裹在脂質體內運輸。相比之下，通過構建shRNA表達載體能在細胞內長時間、穩定地生成shRNA。

慢病毒載體本身以及NC-shRNA序列不影響靶基因及其表達蛋白的改變，但會使細胞增殖速度出現減慢趨勢，細胞生長受到一定程度的抑制，細胞凋亡率增加〔11，12〕?？梢娐《绢w粒對細胞有一定程度的毒性作用。針對mRNA設計的siRNA序列能特異性地與目的基因BHRF1-shRNA結合，并降解mRNA，進一步使CNE2 mRNA表達下降，引起細胞生長受到抑制，細胞增殖速度減慢，細胞凋亡增加。

4參考文獻

1Yang CF，Peng LX，Huang TJ，etal.Cancer stem-like cell characteristics induced by EB virus-encoded LMP1 contribute to radioresistance in nasopharyngeal carcinoma by suppressing the p53-mediated apoptosis pathway〔J〕.Cancer Lett，2014；344(2)：260-71.

2Li Z，Chen X，Li L，etal.EBV encoded miR-BHRF1-1 potentiates viral lytic replication by downregulating host p53 in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2012；44(2)：275-9.

3Kim dN，Lee SK.Biogenesis of Epstein-Barr virus microRNAs〔J〕.Mol Cell Biochem，2012；365(1-2)：203-10.

4Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011；61(2)：69-90.

5范才文，田晶，王建紅，等.Stathmin表達抑制的鼻咽癌細胞系建立〔J〕.中國現代醫學雜志，2012；22(9)：43-7.

6Yang F，Zhuo L，Ananda S，etal.Role of reactive oxygen species in triptolide-induced apoptosis of renal tubular cells and renal injury in rats〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011；31(3)：335-41.

7劉瑾，楊青，蘭亞佳，等.肺癌患者端粒酶表達的meta分析〔J〕.中國肺癌雜志，2001；4(4)：299-302.

8宋玉姣，韓繼波，陳始明，等.腺病毒介導的shRNA沉默hTERT基因表達對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.腫瘤防治研究，2011；38(12)：1351-5.

9Fu Q，Jiang ZZ，Zhang LY.Impairment of triptolide on liver mitochondria in isolated liver mitochondria and HL7702 cell line〔J〕.Chin J Integr Med，2013；19(9)：683-8.

10Borja-Cacho D，Yokoyama Y，Chugh RK，etal.TRAIL and triptolide：an effective combination that induces apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.J Gastrointest Surg，2010；14(2)：252-60.

11李剛，譚曉虹.RNA干擾survivin對口腔表皮樣癌細胞株KB生長的抑制作用〔J〕.腫瘤防治研究，2011；38(3)：257-60.

12Yinjun L，Jie J，Yungui W.Triptolide inhibits transcription factor NF-kappaB and induces apoptosis of multiple myeloma cells〔J〕.Leukemia Res，2005；29(1)：99-105.

〔2013-09-15修回〕

(編輯馮超)