異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能改變與腦海馬CA1區谷氨酸水平變化的關系

異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能改變與腦海馬CA1區谷氨酸水平變化的關系

徐誠實曲向東吳安石1岳云1王庚

(北京積水潭醫院麻醉科，北京100035)

摘要〔〕目的觀察異氟烷麻醉后老年大鼠學習/記憶功能障礙模型中海馬CA1區谷氨酸濃度的動態變化，探討術后認知功能障礙(POCD)的可能機制。方法將38只老年大鼠(≥18月齡)隨機分為3組：對照組(n=6；不接受迷宮訓練和麻醉)、空氣吸入組(n=7，接受迷宮訓練但不接受麻醉)、異氟烷麻醉組(n=25，接受迷宮訓練和麻醉)。應用Morris水迷宮對大鼠進行學習/記憶功能測試，根據迷宮測試成績將異氟烷麻醉組大鼠進一步分為學習/記憶功能明顯受損亞組(MIS組)和學習/記憶功能無明顯受損亞組(NMIS組)。應用活體腦微透析系統收集不同時間點大鼠腦海馬CA1區的腦脊液并應用高效液相色譜法(HPLC)測定腦脊液樣本中的谷氨酸濃度。結果接受異氟烷麻醉的大鼠學習/記憶功能明顯受損的發生率為12.0%(3/25)。異氟烷麻醉組大鼠麻醉過程中的谷氨酸濃度均明顯低于對照組和空氣吸入組(P<0.05)。異氟烷麻醉組大鼠麻醉結束后1 h時腦脊液谷氨酸濃度明顯低于空氣吸入組(P<0.01)，但與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。對照組和空氣吸入組大鼠在各時間點腦脊液谷氨酸濃度均無統計學差異(P>0.05)。 異氟烷麻醉過程中，對照組和空氣吸入組腦脊液谷氨酸濃度均明顯高于NMIS 亞組(P<0.05)和MIS亞組(P<0.05)。麻醉1 h后，空氣吸入組谷氨酸水平明顯高于NMIS和MIS兩亞組(P<0.01)，而MIS亞組谷氨酸水平明顯低于對照組(P<0.05)。麻醉后24 h時，MIS亞組谷氨酸水平明顯高于對照組和NMIS亞組(P<0.05和<0.01)。麻醉后首次水迷宮訓練時，MIS組谷氨酸濃度明顯高于NMIS組(P<0.05)。麻醉48 h以后各個時間點，MIS亞組谷氨酸水平均明顯高于其余3組。 結論異氟烷麻醉學習/記憶功能障礙大鼠模型中海馬CA1區谷氨酸水平呈持久性升高，提示麻醉后腦內高谷氨酸水平可能與麻醉藥引發的學習/記憶功能障礙的病理生理過程有關。

關鍵詞〔〕谷氨酸；異氟烷；學習/記憶功能受損；Morris水迷宮

中圖分類號〔〕R749〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.30872435)

通訊作者：王庚(1970-)，男，主任醫師，副教授，主要從事神經阻滯、腦功能、血液保護研究。

1首都醫科大學附屬北京朝陽醫院麻醉科

第一作者：徐誠實(1981-)，男，住院醫師，主要從事神經阻滯、腦功能、血液保護研究。

作為腦內最豐富且最重要的興奮性神經遞質，谷氨酸參與了腦內大部分功能。然而，谷氨酸濃度過高會導致細胞腫脹或神經細胞壞死等細胞結構或功能的損傷〔1～4〕，即興奮毒性效應。有學者認為興奮毒性效應是神經細胞死亡以及認知功能障礙的最終共同通路，是多種神經系統疾病的基礎〔5～9〕。雖然在多種原因導致的認知功能障礙中都伴有腦內或血液谷氨酸水平的變化〔10，11〕，但是否在術后認知功能障礙(POCD)發病過程中也伴有谷氨酸濃度水平的變化及其變化趨勢至今仍不清楚。本文擬分析異氟烷引發的認知功能受損與谷氨酸濃度變化之間的關系。

1材料和方法

1.1實驗動物在得到醫院實驗動物倫理委員會批準后，從四川省醫學科學院實驗動物中心訂購老年大鼠50只(年齡>18月，體重400～550 g)。將大鼠在標準飼養箱中喂養，飼養室和實驗室溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%；安靜環境，避免強光、噪音等刺激；12∶12 h的生活節律下自由進食進飲。所有大鼠均常規熟悉實驗室環境和實驗人員2 w。

1.2海馬微透析模型的建立及分組經大鼠尾靜脈按照15 mg/kg的速度注入異丙酚，待大鼠體動反應消失后按照10 mg·kg-1·h-1的速度持續泵注異丙酚維持麻醉。用16G套管針對大鼠進行氣管插管，插管成功后將大鼠固定在小動物立體定位儀(ASI公司，美國)上并調整螺絲使大鼠顱頂呈水平位。應用小動物呼吸機進行機控呼吸(潮氣量7～9 ml/min，呼吸頻率65～70次/min，吸呼比1∶2)，將兒童脈搏氧飽和度探頭固定于大鼠腳趾，監測SpO2；根據SpO2調節呼吸參數，使SpO2≥95%。將小動物體溫自動控制器溫度探頭置入大鼠直腸并將溫度設為38℃以維持大鼠正常體溫。切皮前備皮并用強力碘將備皮區域消毒后酒精脫碘，常規鋪高壓滅菌消毒洞巾，操作過程嚴格執行無菌操作。在小動物立體定位儀引導下將微透析探針(CMA/12 14/02，CMA/Microdialysis)準確置入大鼠海馬CA1區(前囟向后4.5 mm，旁開2 mm，深度為顱骨下2 mm)，然后用消毒過的銅絲和牙粉將導管固定在大鼠顱骨上。所有大鼠均常規喂養1 w，如傷口愈合良好、無滲血滲液、活動狀態佳、無神經損害癥狀等即進行水迷宮測試和微透析實驗。

最終有38只大鼠納入實驗，隨機分為3組：對照組(n=6；不接受迷宮訓練和麻醉)、空氣吸入組(n=7，接受迷宮訓練但不接受麻醉)和異氟烷麻醉組(n=25，接受迷宮訓練和麻醉)。在特定的時間點收集微透析組大鼠海馬CA1區腦脊液。

1.3行為學測試應用Morris水迷宮對大鼠進行學習/記憶能力測試，分為定向航行實驗和空間探索實驗兩個部分。

定位航行試驗用于測量大鼠獲取空間學習記憶的能力。將水迷宮分為4個象限，試驗開始前至少2 h將大鼠放入池中自由游泳90 s，不放置平臺，讓其熟悉迷宮環境。正式進行水迷宮測試時，將平臺置于某一象限中部，將大鼠分別從4個象限不同入水點面向池壁放入水池，直至找到隱藏在水面下的平臺為止。找到平臺后允許動物在平臺上滯留60 s；如果動物在90 s內沒有找到平臺，則實驗者幫助動物找到平臺(潛伏期記為120 s)，在平臺上休息60 s，再進行下次實驗。通過自動錄像系統記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期，ELP)、路線圖、游泳速度等。吸入空氣或異氟烷麻醉前后的行為學測試分別歷時5 d，每天上、下午各進行1次。

空間探索試驗用于評測大鼠保持對平臺空間位置記憶的能力。在第5天的最后一次定位巡航試驗后去除平臺，然后任選一個入水點將大鼠放入水池中，記錄大鼠在90 s內搜索平臺的路線圖和在目標區域的滯留時間。

Morris水迷宮檢測結束后，水池內換成清水，使水面略低于平臺進行大鼠視力測試，以檢測大鼠視力是否正常。

1.4異氟烷麻醉將大鼠置入特制的麻醉箱內進行異氟烷麻醉，異氟烷濃度為1.2%，歷時2 h。麻醉過程中將小動物體溫自動控制器體溫探頭置入大鼠直腸，并將溫度設定為38℃。麻醉過程中常規監測血氧飽和度并應用無創小動物血壓計(ZH-HX-Z，安徽省)測量尾靜脈血壓。

1.5海馬腦脊液微透析樣本的獲取除異氟烷麻醉過程外，所有活體微透析實驗均在大鼠清醒、自由活動條件下完成。將大鼠移至自由活動大鼠微透析系統內，在大鼠合作的情況下將探針置入導管抵達大鼠海馬，連接自由活動系統。微透析系統內應用人工腦脊液(內含NaCl 147 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，CaCl21.2 mmol/L，MgCl20.85 mmol/L)灌注，微量泵(CMA/102 microdialysis pump，CMA/Microdialysis AB，Stockholm，Sweden)泵速為2.5 μl/min并預充1 h以確保微透析系統內人工腦脊液灌注完全。未進行行為學測試前進行一次微透析，此后分別在麻醉前行為學測試結束后、麻醉過程中、麻醉后1、12、24和48 h以及麻醉后每次行為學測試后均進行微透析操作。微透析樣本均在0℃條件下收集且收集時間設定為15 min，收集完畢后將微透析樣本立即轉移到-80℃冰箱保存備測。

1.6質量控制接受異氟烷麻醉的大鼠在麻醉過程中均進行動脈血氣分析(見表1)，麻醉過程中發生低氧血癥的大鼠均不納入研究。實驗結束后，用水合氯醛麻醉大鼠并用磷酸鹽緩沖液(PBS)+10%甲醛溶液進行灌注，待組織固定后取腦并將腦組織沿冠狀面切成40 μm厚的薄片進行蘇木素-伊紅(HE)染色以確定微透析探針位置，位置不當者予以排除。

表1　異氟烷麻醉中生理指標和動脈血氣分析結果 ± s)

1.7谷氨酸濃度的測定應用高效液相色譜法(HPLC，Agilent 1200)測定微透析樣本中的谷氨酸濃度。HPLC系統由四元泵(Agilent G 1311A)、熒光探測儀(G 1321 A)、柱溫箱(Agilent G 1316A)以及安捷倫化學工作站組成。(1)柱前自動衍生化：取5 mg鄰苯二甲醛(OPA)溶于120 μl甲醇中，充分溶解后加入10 μl β-巰基乙醇和1 ml 0.2 mol硼酸緩沖液(pH 9.2) 搖勻避光4℃冷藏備用。(2)色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150 mm,5 μm)；流動相，A為緩沖液，甲醇：四氫呋喃=400∶95∶5；B為緩沖液，甲醇=120∶380,緩沖液為20 mmol/L乙酸鈉溶液(pH 7.2)。梯度洗脫程序:0～10 min，B%為0%～65%；10～12 min，B%為63%～63%；12.00～12.01 min，B%為63%～100%；12.01～17.00 min，B%為100% ～100%；17.00～18.00 min，B%為100%～0%；18.00～22.00 min，B%為0%～0%。流速:0.8 ml/min；檢測波長:激發光波長λex=340 nm,發射光波長λem = 450 nm。柱溫40℃,進樣量15 μl。(3)自動程序進樣：25 μl氨基酸樣品溶液，加入7.5 μl衍生化試劑，自動混勻6次，反應0.5 min后立即進樣。

1.8統計學方法應用SPSS11.5軟件行方差分析和雙變量相關分析。

2結果

2.1水迷宮測試成績若異氟烷麻醉組麻醉后水迷宮訓練的逃避潛伏期較同一時間點空氣吸入組的平均逃避潛伏期延長超過1.96倍SD則認為該大鼠學習/記憶功能明顯受損。依此標準，將異氟烷麻醉組大鼠分為學習/記憶功能明顯受損亞組(MIS組)和學習/記憶功能無明顯受損亞組(NMIS組)〔12〕。依此標準，接受異氟烷麻醉的大鼠學習/記憶明顯受損的發生率為12%(3/25)。

2.1.1定位航行實驗(學習能力)見圖1。

2.1.2空間探索試驗(記憶能力)麻醉前后定位航行實驗測試完畢2 d后均進行空間探索實驗以測試大鼠對平臺空間位置的記憶能力。撤去平臺后觀察90 s內大鼠在目標區域的滯留時間，結果見圖2。

2.1.3行為學測試(游泳速度)接受行為學測試的各組大鼠在麻醉前后游泳速度均無統計學差異，說明微透析探針置入和異氟烷麻醉均未對大鼠的運動能力造成明顯損害，見圖3。

2.2谷氨酸濃度

2.2.1對照組、空氣吸入組和異氟烷麻醉組大鼠不同時間點谷氨酸濃度變化見圖4Ⅰ，麻醉過程中接受異氟烷麻醉的大鼠谷氨酸濃度明顯低于對照組和空氣吸入組(P=0.015，0.011)；在麻醉后1 h時間點上接受異氟烷麻醉的大鼠谷氨酸濃度明顯低于空氣吸入組(P<0.01)，而與對照組相比較無明顯統計學差異(P=0.79)。而在其他時間點上接受異氟烷麻醉的大鼠谷氨酸濃度與對照組和空氣吸入組相比較均無明顯統計學差異。

與空氣吸入組比較：1)P<0.01;與MIS亞組比較：2)P<0.01 圖1　麻醉前后行為學測試成績

2.2.2對照組、空氣吸入組、NMIS組和MIS組大鼠不同時間點谷氨酸濃度變化見圖4Ⅱ對照組和空氣吸入組大鼠谷氨酸濃度在各個時間點上均無明顯統計學差異。麻醉過程中NMIS組和MIS組大鼠谷氨酸濃度均明顯低于對照組和空氣吸入組(P<0.05)。麻醉后1 h時間點上空氣吸入組大鼠谷氨酸濃度明顯高于NMIS組和MIS組 (P<0.01)，MIS組的谷氨酸濃度明顯低于對照組(P=0.03),而與空氣吸入組相比較無明顯統計學差異。在麻醉后24 h時間點上MIS組谷氨酸濃度較對照組和NMIS組明顯升高(P=0.029)，而與空氣吸入組比較無明顯統計學差異。MIS組谷氨酸濃度在麻醉后84 h時間點上明顯高于其余三組(P=0.03，0.019和0.01)。麻醉后第一次行為學測試后MIS組的谷氨酸濃度明顯高于NMIS組(P=0.032)，而在麻醉后行為學測試的其他時間點上MIS組的谷氨酸濃度均明顯高于其余3組(P<0.01)。

與空氣吸入組比較：1)P<0.05；與MIS比較：2)P<0.05 圖2　大鼠定位航行試驗在目標區域滯留時間

圖3　麻醉前后平均游泳速度

與空氣吸入組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與對照組比較:3)P<0.05；與MIS組比較：4)P<0.05；bl= 基礎狀態; pt=麻醉前行為學測試后濃度; ma=麻醉中濃度; pa-1=麻醉后1 h濃度; pa-12=麻醉后12 h濃度; pa-24=麻醉后24 h濃度; pa-48=麻醉后48 h濃度;pat-1～pat-10分別為麻醉后第一～十次行為學測試濃度 圖4　麻醉前行為學測試、麻醉中和麻醉后各個時間點各組谷氨酸濃度變化趨勢圖

2.3麻醉后各個時間點行為學測試成績與谷氨酸相關性除麻醉后NMIS組第5次和第10次行為學測試外，各組海馬內谷氨酸濃度的水平與大鼠的行為學測試成績之間均有明顯相關性(P<0.05)(表2)。

表2　麻醉后各個時間點行為學測試成績與谷氨酸濃度相關性

3討論

由于POCD的患者臨床表現與早期阿爾茨海默病(AD)類似而且POCD可能進一步發展為AD，因此有人認為POCD是AD的一種前期病變〔1〕，且POCD與AD的病理機制類似〔1，10，11〕。近年來麻醉也被認為是除了年齡之外的另一個潛在的危險因素〔13～17〕。到目前為止雖然有許多有關麻醉藥引發認知功能障礙的臨床和動物實驗報道，但是確切機制仍不清楚〔18～21〕。谷氨酸被視為哺乳動物中樞神經系統中最重要的興奮性經遞質〔22〕，正常情況下谷氨酸在長時程增強(LTP)有重要作用，而LTP被認為是學習和記憶過程的基礎，大腦海馬LTP是記憶形成和鞏固過程中神經元活動的客觀指標〔23〕。然而，谷氨酸是一把雙刃劍，在特定情況下可以從一種正常的神經遞質轉變為一種神經毒性物質〔24〕，對腦產生興奮性毒性作用〔2～4〕。有學者認為興奮毒性效應是神經細胞死亡以及認知功能障礙的最終共同通路，是多種神經系統疾病的基礎〔5～9〕，與腦缺血缺氧性疾病、創傷性腦損傷、AD、帕金森病和亨廷頓病等多種神經系統疾病中神經細胞死亡有關〔25〕。雖然關于谷氨酸興奮毒性效應在認知功能受損中的始因性作用已有諸多報道，但是有關異氟烷導致的認知功能受損與谷氨酸系統之間相關性的直觀動態性的證據極少。

蔡桂蘭等〔26〕發現遺忘型輕度認知障礙(aMCI)及AD的患者血清谷氨酸濃度較正常對照者明顯升高。疏樹華等〔27〕也發現患有POCD的老年患者顱內靜脈血內谷氨酸濃度明顯高于未患有POCD的老年患者。雖然他們的研究成果顯示谷氨酸濃度升高與認知功能減退有關，且靜脈血中谷氨酸濃度與腦內谷氨酸濃度有良好相關性，但是靜脈內谷氨酸濃度升高只是腦內谷氨酸濃度的一個反映而并非腦脊液中谷氨酸的真實濃度。而且這些研究都是位相性而非連續性的，因此不能反映在POCD發生發展過程中腦脊液谷氨酸濃度的真實水平和變化趨勢。本研究結果與以上研究不同。更為重要的是，麻醉后谷氨酸濃度升高與異氟烷麻醉后大鼠的迷宮成績之間有明顯相關。也就是說，谷氨酸濃度越高，學習記憶能力越差，這與Temple等〔28〕的研究結果相符合。且Lipton等〔29〕也認為，谷氨酸的興奮性毒性作用是以持續、輕度、慢性、緊張性的方式而非位相性的方式起作用的。

雖然有文獻報道稱學習過程也會導致谷氨酸濃度輕微升高〔30〕，但是筆者認為麻醉后發生認知功能受損大鼠腦脊液中谷氨酸濃度升高并非由迷宮學習過程引起，因為麻醉前接受行為學測試后大鼠腦脊液谷氨酸濃度并未表現出明顯升高而且在認知功能無明顯受損大鼠的腦脊液中也無谷氨酸濃度明顯升高。同樣，雖然有眾多文獻報道腦損傷也會導致谷氨酸濃度升高〔31，32〕，但是筆者認為此持續性谷氨酸濃度升高并非與海馬區微透析導管植入引起的腦損傷有關。據文獻報道〔31〕，如果此谷氨酸濃度升高來源于腦組織損傷，那么谷氨酸濃度會比該實驗中的谷氨酸濃度高很多，因此，筆者將此谷氨酸濃度升高歸因于眾多文獻報道過的異氟烷麻醉誘發的神經元受損〔33～36〕。正因為神經元受損，因此細胞內的谷氨酸外流至細胞外間隙進而引發腦脊液中谷氨酸濃度升高。而此持續緩慢的谷氨酸濃度輕度升高可能是異氟烷引發的認知功能受損的早期表現。

綜上，異氟烷引起的認知功能受損伴有腦海馬CA1區谷氨酸濃度的持續性升高，提示其可能參與異氟烷引發的認知功能受損的病理生理過程。

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〔2015-09-03修回〕

(編輯曲莉)