p130Cas對胃癌細胞AGS增殖和凋亡的影響

p130Cas對胃癌細胞AGS增殖和凋亡的影響

李丹丁健1王錦坡吳婷1王小眾

(福建醫科大學附屬協和醫院消化內科，福建福州350001)

摘要〔〕目的探討p130Cas對胃癌惡性生物學表型的影響及可能的分子機制。方法構建p130Cas siRNA慢病毒載體、p130Cas過表達慢病毒載體和相應的對照載體，轉染AGS細胞株，篩選獲得穩定轉染株；RT-PCR及Western印跡證實載體的有效性；采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)比較慢病毒載體轉染后各組細胞增殖情況；運用AnnexinV-PI流式細胞實驗檢測各組細胞凋亡情況。結果成功構建了p130Cas siRNA慢病毒載體及p130Cas過表達慢病毒載體，構建的慢病毒載體均能高效率的感染AGS細胞，感染慢病毒過表達載體后細胞p130Cas mRNA 及蛋白表達水平明顯升高，感染慢病毒干擾載體后p130Cas mRNA 及蛋白表達水平顯著降低。p130Cas高表達細胞株無外界刺激時p130Cas磷酸化水平未發現有明顯增加(P>0.05)；p130Cas低表達細胞株p130Cas磷酸化水平明顯下降(P<0.05)。高表達p130Cas細胞的增殖和凋亡無明顯影響(P>0.05)；低表達p130Cas組細胞增殖受到抑制，凋亡率明顯升高(P<0.05)。結論p130Cas總蛋白及磷酸化表達水平降低可抑制胃癌細胞株AGS細胞增殖，并促進AGS細胞凋亡，但其總蛋白表達增高對AGS細胞的增殖和凋亡無明顯影響。

關鍵詞〔〕p130Cas；增殖；細胞凋亡；胃癌

中圖分類號〔〕R735.2；R322.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然基金資助項目(81300321)；福建省自然科學基金重點項目(2013J01369)； 福建省自然科學資助項目(2014J01419)；福建省2012臨床醫學重點專科資助項目(閩衛科教〔2012〕149號)

Effects of p130Cas on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells AGS

LI Dan,DING Jian,WANG Jin-Po,etal.

Department of Digestive Diseases,Union Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350001,Fujian,China

Abstract【】ObjectiveTo detect the effects of p130Cas on the malignant biological phenotype and possible molecular mechanism.MethodsLentiviruses,produced with the corresponding plasmids and the packaging plasmids,were used to block expression of p130Cas with p130Cas siRNA and to overexpress p130Cas protein in AGS cells respectively.After transfection,the expression level of p130Cas in cell was detected by PCR and Western blot respectively.Proliferation of cell was examined by MTT.Apoptosis was detected by AnnexinV-PI flow cytometry.ResultsThe recombinant lentiviral vectors carrying human p130Cas siRNA and p130Cas gene were constructed and transfected into AGS cells successfully.The expressions of mRNA and p130Cas protein in AGS cells were increased transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas,both mRNA and p130Cas protein were decreased in AGS cells transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas siRNA.Proliferation was suppressed in AGS cells transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas siRNA(P<0.05).However，proliferation maintained without increasing in AGS cells transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas gene(P>0.05).The apoptotic rate was increased in AGS cells transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas siRNA(P<0.05).Nevertheless,overexpression of p130Cas in AGS cells transfected with recombinant lentiviral vector carrying human p130Cas gene had no effect on cell apoptosis(P>0.05).ConclusionsDownregulation of p130Cas inhibits proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer cell line AGS.Upregulation of p130Cas has no effect on proliferation and apoptosis of AGS cells,which presents p130Cas is an overexpressed gene in AGS.p130Cas gene plays an important role on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell,which makes itself a target for treatment of gastric cancer.

【Key words】p130Cas； Proliferation；Cell apoptosis；Gastric cancer

1福建醫科大學附屬第一醫院消化內科

第一作者：李丹(1976-),女,博士，副主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事胃癌致病機制的研究。

BCAR1/p130Cas定位于16q22-q23染色體，由7個外顯子組成，參與黏著斑的形成和相應的信號轉導。p130Cas在多種腫瘤細胞中過表達，且與腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為密切相關〔1，2〕。本研究旨在了解p130Cas對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細胞株和質粒載體病毒包裝細胞293T細胞及胃癌細胞系 AGS購自ATCC。大腸桿菌DH5α購自上海吉凱基因公司，過表達慢病毒載體系統pGC-FU載體及RNA干擾慢病毒載體系統均購自上海吉凱基因公司，RNA干擾慢病毒載體系統包括pGCSIL-GFP 載體、pHelper 1.0 載體和 pHelper 2.0 載體。

1.2主要試劑M-MLV逆轉錄酶、Rnase Inhibitor、 dNTPs為美國promega公司產品； SYBR Master Mixture、DL 2 000 DNA Marker、Taq polymerase、各種內切酶、T4DNA ligase 、Taq polymerase等購自日本Takara公司；質粒提取試劑盒由德國QIANGEN 公司生產；MTT 試劑盒、細胞凋亡試劑盒(Annexin-V-FITC/PI)、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒為上海碧云天公司產品；BSA及臺酚藍由上海捷倍思基因技術有限公司生產； ECL-PLUS/Kit由美國Amersham公司產品； Lipofectamine 2000、Trizol由美國Invitrogen公司產品； AxyPreP Plasmid MiniPrep Kit、Axyprep PCRCleanuP Kit、AxyprepDNA Gel Extraction Kit、AxyPrep Plasmid Miniprep Kit產生美國Axygen公司；胎牛血清、RPMI1640培養基、Opti-MEM、 DMEM培養基購自美國GIBCO公司；抗p130Cas和抗p130Cas磷酸化抗體為英國Abcam公司生產； NC膜、ECL試劑盒由美國millpore 公司提供。

1.3方法

1.3.1細胞培養和處理AGS細胞常規培養于RPMI 1640培養液含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg/ml)和青霉素(100 μg/ml)，于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養，隔天換液，3到4 d傳代。

1.3.2Real-time PCR檢測胃癌細胞系p130Cas基因表達Trizol法提取胃癌細胞SGC-7901，H1299， MKN45，AGS的總RNA，紫外分析測定所抽提RNA的濃度，RNA 逆轉錄獲得 cDNA ，Real-time PCR 法檢測 p130Cas基因表達。

1.3.3p130Cas siRNA慢病毒載體的構建設計的siRNA序列信息為：CCTTGCAGTACCCATCGCCTT。復蘇并擴增DH5α菌種(含有pGCSIL-GFP質粒)，抽提pGCSIL-GFP質粒，以EcoRI對質粒進行雙酶切后回收酶切產物，利用T4 DNA連接酶將線性化的pGCSIL-GFP載體和目的基因p130Cas在連接緩沖液中16℃過夜連接。以氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞，重組載體的轉化感受態細胞。由上海吉凱基因公司對重組siRNA-p130Cas慢病毒載體進行測序及比較。將重組慢病毒載體轉染293T細胞后收獲病毒并測定病毒滴度。

1.3.4p130Cas 過表達慢病毒載體構建設計合成如下引物：p130Cas (正義)：5'-gaattcatgcctgccaagcccttcct-3 '，p130Cas(反義)：5'- ggatcctcaggcggctgccagctggc-3 '復蘇并擴增DH5α菌種(含有pGC-FU質粒)，抽提pGC-FU質粒，以Age I 和 BamH I對質粒進行雙酶切后回收酶切產物，連接后重組載體轉化感受態細胞，同上步驟測序及進行病毒包裝。

1.3.5重組慢病毒載體感染AGS細胞和獲取穩定轉染細胞株取對數生長期的AGS細胞，按每孔2×105個細胞鋪入24孔板，37℃細胞培養箱過夜，第2天細胞約為密度約50%。取包裝好的慢病毒p130Cas siRNA載體， p130Cas過表達載體及相應的對照載體，置于冰上融化，除去AGS細胞的培養液，加入稀釋混勻的病毒液，上下左右輕輕搖勻，37℃細胞培養箱培養 8～12 h，移除含病毒的培養液，更換含10%胎牛血清的1640培養液，繼續培養2～3 d，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達情況結合流式分選獲得穩定感染細胞株。

1.3.6逆轉錄PCR檢測各轉染細胞系p130Cas基因表達抽提各轉染細胞組的質粒進行PCR反應，循環參數為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共25～35個循環，最后72℃延伸7 min。 取8 μl PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外光下自顯影，經計算機掃描成像。

1.3.7細胞總蛋白提取胰酶消化收集各轉染組及對照組細胞，加入混有PMSF的RIPA細胞裂解液，于冰上利用超聲儀超聲裂解細胞，4℃，12 000 r/min離心5 min，轉移上清至新的EP管，采用Bradford法測定目的蛋白濃度。

1.3.8Western印跡檢測各組細胞 p130Cas蛋白水平各組取80 μg總蛋白量的樣品液，聚丙烯酰胺凝膠電泳后經硝酸纖維素膜轉移，將膜在含10%脫脂奶粉TBS中封閉2 h后，與p130Cas單克隆抗體中4℃孵育過夜，洗滌后再與相應的二抗室溫下作用1 h，經ECL底物化學發光顯影，掃描為圖片，經Image J軟件測量膠片中條帶灰度值。

1.3.9Western印跡檢測各組細胞p130Cas磷酸化水平各組取80 μg總蛋白量的樣品液，電泳后轉移至硝酸纖維素膜，封閉后與抗p130Cas磷酸化抗體4℃孵育過夜，洗滌后再與相應二抗室溫下作用1 h，發光顯影后測量膠片中條帶灰度值。

1.3.10四甲基偶氮唑藍比色(MTT)實驗檢測各組細胞增殖能力MTT粉溶解于PBS緩沖液配制成MTT工作液，濃度為5 mg/ml，4℃避光保存。 取對數生長期的穩定感染p130Cas siRNA和過表達p130Cas的AGS細胞及對照組細胞，胰酶消化重懸為單個細胞懸液，接種7塊96孔板，每孔細胞數為 2 000個，每孔體積200 μl，每孔設置4個復孔，培養3 d后取出96孔板，每孔加入20 μl MTT工作液溶液，二氧化碳孵育箱培養4 h，吸去培養上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，將 96孔板放入酶聯免疫讀數儀，595 nm波長處，測定各孔的吸光度，其中設置只加培養液的孔作為空白對照孔，計算各組的平均吸光度(OD)值。

1.3.11流式細胞術檢測各組細胞凋亡狀況采用 AnnexinV-PI 法檢測細胞凋亡率。收集對數生長期的穩定感染p130Cas siRNA和過表達p130Cas的AGS細胞及對照組細胞于離心管中，每樣本細胞數為(1～5)×106/ml，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液,孵育緩沖液洗滌1次,離心后用標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，離心5 min后沉淀細胞用孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min，流式細胞儀分析(流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI)。結果判斷：在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC+/PI-)。

1.4統計分析處理使用SPSS17.0軟件行t或χ2檢驗。

2結果

2.1p130Cas在各胃癌細胞系中的表達為檢測p130Cas是否在胃癌細胞株中普遍表達，首先在胃癌細胞系SGC-7901，H1299， MKN45，AGS中利用Real-time PCR檢測p130Cas的表達情況，對照GAPDH和BCAR1基因表達引物采用軟件Beacon designer 2設計。SGC-7901，H1299， MKN45，AGS細胞均高表達BCAR1/p130Cas基因表達豐度能滿足檢測實驗要求，本實驗選取AGS細胞為研究對象。見圖1。

1：SGC-7901 2：H1299 3：MKN45 4：AGS M：DNA Marker DL1 000 內參擴增產物電泳圖 圖1　P130Cas在各胃癌細胞系中的表達

2.2p130Cas siRNA慢病毒載體的鑒定

2.2.1pGCSIL-GFP載體的酶切鑒定使用EcoRI對pGCSIL-GFP載體進行酶切，酶切產物電泳檢測結果。見圖2。

1.未酶切的載體質粒；2、3、4:EooRI酶切線性化后的載體質粒；5.Marker 圖2　pGCSIL-GFP載體酶切產物電泳結果

2.2.2p130Cas siRNA慢病毒載體的測序鑒定 設計的p130Cas siRNA慢病毒載體經上海吉凱公司測序鑒定，經驗證siRNA插入正確， siRNA慢病毒載體構建成功。

2.3p130Cas過表達慢病毒載體的鑒定

2.3.1pGC-Fu載體的酶切鑒定使用Age I和 BamH I對pGC-Fu載體進行雙酶切。酶切產物電泳檢測結果。見圖3。

1.沒有酶切的載體質粒；2.AgeⅠ和BamHⅠ酶切線性化后的載體質粒；3.Marker 圖3　pGC-Fu載體酶切產物電泳結果

2.3.2p130Cas過表達慢病毒載體的測序鑒定 設計的p130Cas慢病毒載體經上海吉凱公司測序鑒定，經驗證p130Cas插入正確，慢病毒過表達載體構建成功。

2.4PCR檢測慢病毒載體轉染后各組細胞p130Cas表達情況p130Cas慢病毒過表達載體及慢病毒siRNA載體分別感染胃癌AGS細胞,半定量PCR檢測p130Cas表達結果提示轉染慢病毒過表達組p130Cas表達明顯增高，感染慢病毒siRNA載體組p130Cas基因表達明顯受到抑制，見圖4。

2.5各細胞組中總p130Cas的表達情況及磷酸化水平檢測與對照組及空載體組相比，慢病毒過表達載體組p130Cas表達量明顯增加(P<0.05)；而慢病毒siRNA載體組p130Cas表達量與其對照組和空載體組比較顯著下降(P<0.05)。同時為了明確細胞體外的磷酸化水平，Western印跡法檢測在未添加任何刺激物情況下的各組細胞p130Cas蛋白的磷酸化情況，結果發現，在未添加刺激物的情況下體外細胞AGS細胞、NCRNAi組及NC過表達組即可檢測到p130Cas磷酸化，三者兩兩之間無差異(P>0.05)；與對照組及空載體組相比，轉染siRNA載體組的胃癌細胞中p130Cas磷酸化水平下降(P<0.05)；而轉染過表達載體組與對照組和空載體組相比，胃癌細胞中p130Cas磷酸化水平無變化(P>0.05)，見圖5。

2.6p130Cas 的表達對 AGS細胞體外增殖能力的影響p130Cas過表達組與其對照組和空載體組間分別比較均無差異(0.353±0.075、0.374±0.045、0.401±0.026,P>0.05)；p130Cas siRNA組(0.233±0.055)與其對照(0.386±0.065)及空載體組間分別比較兩者的差異顯著(P<0.05)。

2.7p130Cas 的表達對AGS細胞凋亡的影響與空載體組及NCRNAi轉染的AGS細胞相比，利用p130Cas siRNA載體下調p130Cas基因表達后，AGS細胞凋亡率增加，達到49.78%(P<0.05)；上調胃癌細胞株AGS細胞p130Cas基因表達后，AGS細胞凋亡與其對照組及空載體組相比較無差異(P>0.05)。

1.marker;2.p130cas過表達組;3.NC表達組;4.p130cas阻斷組;5.NCRNAI組;6.AGS細胞組 圖4　PCR檢測慢病毒載體轉染后各組細胞 p130Cas表達情況

1～5：p130Cas阻斷組、NC RNA組、p130Cas過表達組、NC過表達組、AGS細胞組 圖5　Western印跡檢測各細胞組p130Cas蛋白 表達及磷酸化水平變化

3討論

本研究結果提示p130Cas的表達可能在胃癌細胞生物學功能中發揮重大作用。在此基礎之上本實驗分別成功構建了p130Cas慢病毒干擾載體和過表達載體及相應的對照載體，在證實慢病毒載體構建成功之后，分別用上述病毒載體感染AGS細胞，篩選出穩定感染的細胞株。

本研究提示阻斷p130Cas表達和活化可以抑制胃癌細胞的增殖。阻斷p130Cas可以促進胃癌細胞凋亡。

本研究結果與既往研究并不矛盾，Cabodi等〔3〕通過動物實驗發現，p130Cas過表達可促進乳腺上皮廣泛增生，只有磷酸化的p130Cas才能激活小GTPases Ras和Rac，使下游的JNK和Erk1/2-MAPK激活〔4〕，最后形成的AP-1轉錄激活子能夠提高特定靶基因的轉錄水平進而調節細胞增殖〔5〕。本研究提示在體外未添加刺激物情況下胃癌細胞p130Cas即有多量磷酸化，屬于過表達的分子，這可能與整合素活化、生長因子刺激、G蛋白耦聯受體的肽激素配體、機械牽張等多種原因誘導p130Cas磷酸化有關，并導致p130Cas磷酸化程度在細胞中呈現飽和狀態，這解釋了MTT試驗結果顯示的p130Cas高表達組未能促進細胞增殖的原因。同樣，目前大部分研究證實p130Cas有抗凋亡作用〔6〕。最近一項研究顯示野生型p130Cas的過表達在凋亡中起保護細胞的作用〔7〕，而抑制p130Cas表達誘導細胞凋亡。Ta等〔8〕研究表明p130Cas過表達事實上對促凋亡刺激來說是個障礙。結合本研究結果證實胃癌p130Cas自身磷酸化水平呈現“過表達”的飽和狀態，發揮著重要的抗凋亡作用。

4參考文獻

1Uedo N,Iishi H,Tatsuta M,etal.Longterm outcomes after endoscopic mucosal resection for early gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer,2006;9(2):88-92.

2Matsuda M,Mayer BJ,Fukui Y,etal.Binding of transforming protein,P47gag-crk,to a broad range of phosphotyrosine-containing proteins〔J〕.Science (New York,N.Y.),1990;248(4962):1537-9.

3Cabodi S,Tinnirello A,Bisaro B,etal.p130Cas is an essential transducer element in ErbB2 transformation〔J〕.FASEB J,2010;24(10):3796-808.

4Giancotti FG,Tarone G.Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling〔J〕.Ann Rev Cell Dev Biol,2003;19(1):173-206.

5Minden A,Karin M.Regulation and function of the JNK subgroup of MAP kinases〔J〕.Biochim Biophys Acta,1997;1333(2):F85-104.

6Nick AM,Stone RL,Armaiz-Pena G,etal.Silencing of p130Cas in ovarian carcinoma:a novel mechanism for tumor cell death〔J〕.J Natl Cancer Inst,2011;103(21):1596-612.

7Cho SY,Klemke RL.Extracellular-regulated kinase activation and CAS/Crk coupling regulate cell migration and suppress apoptosis during invasion of the extracellular matrix〔J〕.J Cell Biol,2000;149(1):223-36.

8Ta HQ,Thomas KS,Schrecengost RS,etal.A novel association between p130Cas and resistance to the chemotherapeutic drug adriamycin in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2008;68(21):8796-804.

〔2015-04-18修回〕

(編輯李相軍)