表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

白玉劉尚國1姚文健1趙寶生1

(新鄉醫學院病理教研室，河南新鄉453003)

摘要〔〕目的探討表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。方法將EC9706細胞培養并加入不同濃度的吉非替尼處理不同時間后，采用MTT法檢測細胞增殖抑制率；AnnexinV-FITC/PI雙染法、流式細胞儀檢測細胞凋亡率。PI染色、流式細胞儀檢測細胞周期。結果吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖具有明顯的抑制作用，且表現為劑量和時間依賴性；吉非替尼組細胞凋亡率明顯高于正常對照組，且隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加(P<0.05)；與對照組相比，10 μg/ml吉非替尼處理24 h后的EC9706細胞，處于G0/G1期細胞比例明顯增加，處于S期細胞比例明顯減少(P<0.05)。結論吉非替尼對食管癌EC9706細胞具有明顯的增殖抑制作用，其機制與誘導凋亡及阻滯細胞周期有關。

關鍵詞〔〕吉非替尼；食管癌；增殖；凋亡

中圖分類號〔〕R735.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省衛生廳資助課題(200803081)

通訊作者：趙寶生(1966-)，男，主任醫師，教授，碩士，主要從事食管癌研究。

Doi7Hara F,Aoe M,hara H,et al.Antitumor effect of gefitinib (Iressa) on esophageal squamous cell carcinoma cell lines in vitro and invivo〔J〕.Cancer Lett,2005；226 (1):37-47.

1新鄉醫學院第一附屬醫院胸外科

第一作者：白玉(1981-)，女，講師，碩士，主要從事腫瘤分子病理研究。

分子靶向藥物因其靶點明確、特異性強等優點，正引起人們的廣泛關注，是目前腫瘤治療的研究熱點。目前分子靶向藥物的研究主要集中在表皮生長因子受體(EGFR) 上。EGFR為一種相對分子質量為170 000 kD的酪氨酸蛋白激酶受體，在多種惡性腫瘤均存在過表達，其中食管癌EGFR的表達率高達40%～70%〔1〕。目前開發的作用于EGFR的藥物有2種，一種是靶向EGFR胞外域的單克隆抗體，如EGFR阻斷劑西妥昔單抗；一種是靶向受體催化域的EGFR酪氨酸激酶，如酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼。已有研究顯示，吉非替尼對多種惡性腫瘤如肺腺癌細胞〔2〕、乳腺癌細胞〔3〕及肝癌細胞〔4〕等都有顯著抑制作用，但關于治療食管癌的研究報道還較少。因此，本實驗擬在細胞水平上研究吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。

1材料與方法

1.1試劑與儀器吉非替尼(商品名：易瑞沙)為阿斯利康公司產品。食管癌EC9706細胞購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)染液購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；DNM-9602A酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；流式細胞儀及分析軟件(美國BD公司)；其他常用試劑及儀器由新鄉醫學院病理學實驗室提供。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養食管癌EC9706細胞用含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養液，在37℃、5%CO2、濕度85%的細胞培養箱中培養，每2～3天更換培養液并傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2檢測細胞增殖抑制率用MTT法檢測吉非替尼對EC9706細胞增殖的抑制作用。吉非替尼用DMSO配置為20 mg/ml的母液，置于-20℃的冰箱中保存。用時常溫解凍后，用RPMI-1640稀釋至所需濃度(DMSO的最終濃度不超過0.1%)。取對數生長期的EC9706細胞，調整細胞濃度為5×105/ml，每孔200 μl加入96孔板，置于培養箱中培養。24 h后加入濃度分別為10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼。同時設置調零組和對照組：分別加入等量完全培養液和含EC9706細胞的培養液。每組設5個復孔，分別孵育12、24 和48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl繼續培養4 h。終止培養，小心吸去孔內培養液，加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。以上實驗重復3次。計算細胞抑制率，抑制率= (1-加藥組OD490值/對照組OD490值)×100%。

1.2.3細胞凋亡檢測培養收集濃度為10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼處理48 h后的EC9706細胞。對照組設為不加藥物含EC9706細胞的培養液。常規胰酶消化后，制成單細胞懸液，每管細胞數達到1×106個。4℃離心棄上清液，再經預冷的PBS液洗2次，按AnnexinV-FITC/PI試劑盒提供方法用150 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，輕輕混勻后，避光室溫反應15 min，反應接受后再加入200 μl結合緩沖液。流式細胞儀上樣進行檢測。本實驗重復3次。

1.2.4細胞周期分析取對數生長期的細胞制成1×106/ml的單細胞懸液，接種在6孔板培養24 h后，加入10 μg/ml的吉非替尼，對照組設為不加藥物的培養液，繼續培養24 h后胰酶消化，離心后棄去上清。用PBS液洗2次，加入70 %冰乙醇固定，4℃過夜。上機前，離心去乙醇，PBS洗2次。加入1 ml PBS制成細胞懸液，用100 μl RNaseA消化，37℃水浴30 min。加1 ml PI染液(100 μg/ml)，避光30 min，最后通過流式細胞儀檢測細胞周期，得出細胞周期的百分率。

2結果

2.1吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖的抑制作用與對照組相比，吉非替尼組EC9706 細胞的生長明顯受到抑制(P<0.05)。隨著藥物濃度提高，EC9706 細胞的增殖抑制率逐漸升高；當藥物濃度固定時，細胞的增殖抑制率隨著作用時間延長而相應升高(P<0.05)。隨著吉非替尼濃度的增大和作用時間的延長，EC9706 細胞的增殖抑制率也逐漸增加，呈劑量依賴性和時間依賴性。見表1。

2.2吉非替尼對食管癌EC9706細胞凋亡的影響對照組EC9706細胞自然凋亡率為1.68%±0.54%，10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼作用48 h后細胞凋亡率分別為18.12%±1.58%、29.54%±1.61%、40.01%±2.14%、51.45%±1.96%，均顯著高于對照組(49.21% vs 63.21%,P<0.05)。各組隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期細胞比例無明顯差異(16.68% vs 13.92%，P>0.05)。

表1吉非替尼對食管癌EC9706細胞增殖的抑制作用(%)

吉非替尼濃度(μg/ml)12h24h48h對照組0001018.21)27.81)2)38.41)2)2022.41)36.71)2)51.61)2)4039.51)47.51)2)64.61)2)8046.81)61.81)2)71.21)2)

與前一濃度組比較：1)P<0.05;與前一時間點比較：2)P<0.05

2.3吉非替尼對食管癌EC9706細胞周期的影響與對照組相比，經10 μg/ml的吉非替尼作用24 h后的EC9706細胞，G0/G1期細胞比例明顯增加(49.21% vs 63.21%,P<0.05)；S期細胞比例明顯減少(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期細胞比例無明顯差異(16.68% vs 13.92%,P>0.05)。

3討論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病隱匿，大多數病例確診時已是晚期，雖然隨著外科手術的進步和早期診斷水平的提高，食管癌的治療取得了不少進展，但患者5年生存率仍不足20%，復發轉移及化療耐藥是影響生存率的主要原因〔5〕。目前臨床急需一種新型的高效安全的食管癌治療途徑。

現在許多學者開始積極探索靶向藥物治療，針對不同細胞表面分子的新型靶向藥物不斷涌現，其中作用于EGFR的靶向藥物是最為重要的一類。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，主要參與細胞的增殖、生長、遷移、浸潤與存活。EGFR信號通路的異常與腫瘤的惡性表型、正常細胞凋亡的抑制、血管生成以及腫瘤的轉移都密切相關〔6〕。EGFR的生物特性提示它能成為抗癌治療的有效靶點。而70%以上的食管癌中存在EGFR表達或過表達〔7〕。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其作用機制是與ATP 競爭性的結合EGFR 的酪氨酸激酶胞內區位點，抑制EGFR跨膜細胞表面受體上酪氨酸激酶的自身磷酸化，從而阻止細胞增殖，促進凋亡〔8〕。

本實驗結果指示EC9706 細胞對吉非替尼有著較強的敏感性，吉非替尼能明顯抑制EC9706細胞的增殖。吉非替尼對EC9706細胞具有較強的誘導凋亡作用，并且隨著吉非替尼劑量的增加，凋亡率逐漸增加。細胞周期分析顯示吉非替尼能使G0/G1期細胞比例明顯增加。G0期為停止細胞分裂的靜止期，G1期為DNA合成前期，吉非替尼能使細胞發生G0/G1期阻滯，從而抑制了細胞的有絲分裂，起到遏制癌細胞增殖和擴散的作用。

4參考文獻

1何向明.分子靶點藥物治療食管癌的臨床研究進展〔J〕.中國腫瘤,2009；18(2):300-3.

2王亞麗,牟曉燕,游力,等.吉非替尼對肺腺癌細胞增殖和表皮生長因子受體表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2010；30(6):805-8.

3李曉莉,姜明哲.吉非替尼對人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.中國腫瘤,2010；19(4):270-4.

4魏超,周乃珍,郭慧,等.不同序貫的吉非替尼與化療藥物聯合對人肝癌細胞Bel-7402增殖的抑制作用〔J〕.安徽師范大學學報,2011；12(3):265-8.

5Mariette C,Finzi L,Fabre S,etal.Factors predictive of complete resection of operable esophageal cancer:a prospective study〔J〕.Ann Thorac Surg,2003；75(5)：1720-6.

6唐炳華,王繼峰.醫學分子生物學〔M〕.北京:中國中醫藥出版社,2007：146-7.

8張小玉,鐘國成,李宏斌.分子靶向治療在食管癌的應用進展〔J〕.現代臨床醫學,2009；35(4):243-5.

〔2013-06-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)