姜黃素激活人膀胱癌T24細胞自噬誘導細胞凋亡

論著

姜黃素激活人膀胱癌T24細胞自噬誘導細胞凋亡

仇煒沈永青倪曉辰

項目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(編號：2013005)

作者單位： 050020河北省石家莊市鹿泉區(qū)人民醫(yī)院外科(仇煒，現(xiàn)就讀于首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科)；河北中醫(yī)學院護理學院(沈永青)；河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院泌尿外科(倪曉辰)

E-mail:nixiaochenhb@163.com

【摘要】目的探討姜黃素(Cur)對人膀胱癌T24細胞株的抗腫瘤作用及其對細胞自噬的影響。方法采用CCK-8法檢測Cur對T24細胞增殖的抑制作用；Annexin V/PI法檢測細胞凋亡情況；采用Western blot對細胞LC3B及P62蛋白表達量進行檢測；吖啶橙染色觀察細胞內(nèi)自噬囊泡的改變。結(jié)果Cur可以顯著抑制T24細胞增殖，誘導細胞凋亡(P<0.01)。Cur誘導T24細胞發(fā)生自噬，顯著上調(diào)LC3蛋白表達，下調(diào)P62蛋白表達，增加細胞內(nèi)自噬囊泡的數(shù)量(P< 0.01)。Cur增強順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，CDDP)的促凋亡作用(P<0.01)。結(jié)論Cur可顯著抑制膀胱癌T24細胞的增殖并通過激活細胞自噬促進腫瘤細胞凋亡，Cur可增強CDDP的抗腫瘤效果。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；膀胱癌；凋亡；增殖；自噬

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.004

通訊作者：倪曉辰，050011河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院泌尿外科；

【中圖分類號】R 737.14

收稿日期：(2015-04-27)

The anti-tumor effects of curcumin on human bladder cancer cell line (T24) and its effects on cell autophagy in vitroQIUWei*,SHENYongqing,NIXiaochen.*DepartmentofSurgery,People’sHospitalofLuquanDistrict,Hebei,Shijiazhuang050200,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the anti-tumor effects of curcumin on human bladder cancer cell line (T24) and its effects on cell autophagy in vitro.MethodsThe inhibition effects of curcumin on cell proliferation of T24 cell line were detected by CCK-8 assay. The cell apoptosis rate was determined by Annexin V/PI assay. The expression levels of LC3B and P62 protein were detected by Western Blot. The changes of autophagic vacuoles were observed by acridine orange staining.ResultsCurcumin could obviously inhibit the proliferation of T24 cells and induce cell apoptosis (P<0.01). Curcumin induced autophagy of T24 cells, up-regulated expression levels of LC3 protein, down-regulated expression levels of P62 protein and increased the numbers of autophagic vacuoles (P<0.01). Moreover curcumin enhanced the apoptosis effect of cis-Dichlorodiamineplatinum (CDDP,P<0.01).ConclusionCurcumin can obviously inhibit the proliferation of T24 cells and induce cell apoptosis through cell autophagy, moreover, curcumin can enhance the anti-tumor effects of CDDP.

【Key words】curcumin; bladder cancer; apoptosis; proliferation; autophagy

膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，且隨著我國人口老齡化的加劇、環(huán)境因素等方面的原因，膀胱癌的發(fā)病率仍呈現(xiàn)不斷增高的趨勢。目前，早期膀胱癌的治療仍以手術(shù)為主，及時進行徹底的手術(shù)治療往往能夠收到較為理想的治療效果。然而晚期膀胱癌以及復發(fā)性膀胱癌的治療卻十分困難，目前臨床多給予全身化療。由于化療藥物的副作用較多，在治療期間患者經(jīng)常會遭受巨大痛苦，更為嚴重的是盡管我們現(xiàn)在有很多種化療藥物和方案，但是仍舊無法解決腫瘤耐藥的問題，一旦腫瘤細胞發(fā)生耐藥將會導致整個化學治療的失敗。所以找到一種既能夠減少化療藥物用量，又能夠提高化療效果的辦法就顯得尤為緊迫。姜黃(curcuma longa)作為中藥，在我國具有悠久的應用歷史。姜黃素(Curcumin, Cur)是從姜黃的根莖中提取的一種天然化合物[1]，現(xiàn)代研究表明該化合物具有多種生物學活性[2,3]，同時由于其良好的抗腫瘤效果，Cur在腫瘤研究領(lǐng)域也愈發(fā)受到關(guān)注。已有研究報道，Cur具有抗肝癌[4]、直腸癌[5]等多種腫瘤的作用，此外Cur還能夠增加某些傳統(tǒng)化療藥物的化療效果，如5-氟尿嘧啶、吉西他濱[6-8]等。本研究擬針對Cur對膀胱癌的抗腫瘤效果及其機制進行進一步的探索，為Cur的臨床應用提供實驗室依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料人膀胱癌細胞系T24購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心；RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司；姜黃素、順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，CDDP)、LC3B抗體、吖啶橙(Acridine orange, AO)及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)來自美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8及細胞裂解液為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；BCA法蛋白定量試劑盒為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；P62及GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng):使用胎牛血清終濃度為10%的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)T24細胞，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，每2～3天更換培養(yǎng)液，1∶3 傳代。

1.2.2CCK-8細胞增殖試驗:將處于對數(shù)生長期的T24細胞接種至96孔透明細胞培養(yǎng)板內(nèi)，細胞貼壁后加入Cur處理，之后每孔加入CCK-8試劑10 μl，將細胞重新置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，使用酶標儀比色，比色波長為450 nm。

1.2.3Annexin V/PI細胞凋亡檢測:待檢測細胞消化后，1 000 r/min 5 min離心收集，使用PBS洗滌細胞兩次，緩慢加入結(jié)合緩沖液500 μl，輕微震蕩使細胞重懸，分別加入Annexin V和PI各5 μl，震蕩混勻后避光室溫孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.4Western blot:使用細胞裂解液將待測細胞裂解后，BCA法蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液混勻后加熱變性，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，恒流300 mA 60 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，次日二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光，拍照存檔，本文所使用一抗工作濃度均為1∶1 000。

1.2.5吖啶橙染色試驗：使用PBS緩沖液將OA稀釋至終濃度1 μg/ml，將稀釋好的OA緩慢滴加入待測細胞，避光室溫染色2 min，將OA吸出，并使用PBS緩沖液洗滌兩次。倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。每組最少隨機計數(shù)300個細胞。

2結(jié)果

2.1Cur對人膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的影響分別給予不同濃度(5、10、20 μmol/L)的Cur處理膀胱癌T24細胞24 h，DMSO組細胞增殖未受到明顯影響，但是Cur給藥組細胞增殖均出現(xiàn)了不同程度的下降，Cur濃度為5、10、20 μmol/L時，細胞抑制率分別為3.63%、40.23%、85.73%，其中Cur濃度為10 μmol/L 時，細胞增殖活性受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。使用終濃度為10 μmol/L的Cur孵育T24細胞不同時間(12、24、48 h)再進行CCK-8試驗，結(jié)果表明，隨著給藥時間的延長，T24細胞的增殖活性也受到了不同程度的下降，細胞增殖活性較對照組分別下降了6.47%、44.42%、87.52%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。把10 μmol/L Cur處理了不同時間(24 h、48 h)的T24細胞進行Annexin V/PI染色，然后使用流式細胞術(shù)檢測，Cur給藥組的細胞凋亡率明顯上升，0 h、24 h和48 h的細胞凋亡率分別為(4.08±0.79)%、(12.30±1.22)%和(29.86±1.27)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1～3，圖1～3。

2.2Cur對于T24細胞自噬的影響使用Westernblot檢測T24細胞LC3和P62蛋白的表達量，結(jié)果表明在Cur(10 μmol/L)作用細胞后12 h及24 h，細胞的LC3表達量明顯上升，P62蛋白的表達量明顯下降。使用OA進行染色后進行熒光顯微鏡觀察，在Cur處理組細胞中，自噬囊泡的數(shù)量較對照組明顯增多，含有自噬囊泡的細胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。上述結(jié)果說明，Cur能夠誘導T24細胞發(fā)生自噬，且該作用早于凋亡的發(fā)生。見表4，圖4～6。

圖1Cur對(24 h)作用T24后細胞增殖活力隨劑量增加下降

圖2Cur(10 μmol/L)作用T24后細胞增殖活力隨時間延長下降

圖3Cur(10 μmol/L)作用T24后細胞凋亡率上升

圖4Cur(10 μmol/L)作用T24后細胞后LC3和P62蛋白表達情況

圖5Cur(10 μmol/L，6 h)作用T24細胞后胞質(zhì)后胞質(zhì)內(nèi)自噬囊泡增多(400×)

圖6細胞內(nèi)自噬囊泡計數(shù)

表1　Cur(24 h)作用T24后細胞增殖活力隨劑量增加變化情況　 ±s

注：與0 μmol/L、DMSO、5 μmol/L比較，*P<0.05

表2Cur(24 h)作用T24后細胞增殖活力隨時間變化情況

0hDMSO12h24h48h細胞活力1.000±0.0751.005±0.0200.935±0.012*0.556±0.013*0.125±0.010*

注：與0 h、DMSD比較，*P<0.05

表3Cur(24 h)作用T24后細胞凋亡率變化

0h24h48h凋亡率4.083±0.78812.303±1.221*29.857±1.010*

注：與0 h比較，*P<0.01

表4　細胞內(nèi)自噬囊泡計數(shù)　%, ±s

注：與Ctrl比較，*P<0.01

2.3Cur誘導的細胞自噬與凋亡之間的關(guān)系使用自噬抑制劑3-MA (2 mmol/L)進行試驗，結(jié)果表明3-MA+Cur處理組細胞的凋亡率為(8.44±0.93)%， Cur單獨處理組的凋亡率為(12.30±1.22)%，3-MA+Cur處理組較Cur單獨處理組凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。上述結(jié)果說明，Cur誘導的細胞自噬與其凋亡誘導效應有關(guān)。見表5，圖7。

2.4Cur對CDDP抗腫瘤作用的影響Annexin V/PI檢測結(jié)果表明，Cur和CDDP單獨應用均可以促進T24細胞發(fā)生凋亡，當Cur與CDDP聯(lián)合應用時，誘導腫瘤細胞凋亡的作用更加明顯。對照組細胞凋亡率為(4.03±0.76)%，Cur處理組和CDDP處理組的凋亡率

圖7　Cur (10 μmol/L, 24 h)通過誘導細胞自噬促進細胞凋亡

Cur-+++3-MA-+-+凋亡率3.887±0.7653.713±1.397*13.813±1.896*8.440±0.931#

注：與Cur-、3-MA-比較，*P<0.01；與Cur-、3-MA+比較，#P<0.01

分別為(13.88±2.62)%、(28.11±2.04)%，而Cur+CDDP組的凋亡率則明顯上升，為(47.21±2.08)%。見表6，圖8。

表6　Cur(10 μmol/L，24 h)增強CDDP(30 μmol/L，24 h)

注：與CDDP比較，*P<0.01

3討論

膀胱癌是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，該病的治療現(xiàn)在主要分為手術(shù)、化療、放療三類，早期膀胱癌的治療多以手術(shù)治療為主，晚期膀胱癌及復發(fā)性膀

圖8Cur (10 μmol/L,24 h)增強CDDP (30 μg/ml, 24 h)的凋亡誘導效果

胱癌的治療則多以全身化療為主。目前我國膀胱癌全身化療應用最多的是吉西他濱聯(lián)合順鉑的化療方案(GC方案)，然而化療不僅副作用多，也存在著化療抵抗、化療不敏感、化療耐藥等種種問題。

自噬在細胞正常的生理過程中起著非常重要的作用，自噬能夠維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時自噬也是細胞生理代謝的一個重要組成部分。自噬與人類多種疾病有關(guān)，而自噬與腫瘤的關(guān)系仍不是十分清楚[9]。有假說指出，正常生理情況下，自噬能夠清除可以損傷DNA的物質(zhì)，如錯誤折疊的蛋白質(zhì)、ROS等，從而維持基因組的完整性和穩(wěn)定性，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。而當腫瘤形成后，自噬可以提供給腫瘤細胞更多的能量，給予其更強的生存優(yōu)勢，具有促進腫瘤細胞生長的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Cur具有顯著地抗膀胱癌作用，能夠顯著抑制膀胱癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。同時我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur能夠激活膀胱癌細胞自噬。LC3蛋白是細胞自噬的標志蛋白，在自噬過程中，LC3-Ⅰ酯化形成 LC3-Ⅱ型蛋白并定位于自噬泡上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur能夠顯著促進LC3-Ⅱ的形成，LC3-Ⅱ的表達量明顯上升(圖2A)。P62蛋白是自噬的特異性底物，在給予了Cur處理后，T24細胞的P62表達量明顯下調(diào)(圖2A)。使用OA染色細胞進行形態(tài)學觀察，也表明Cur處理后的細胞自噬囊泡的數(shù)量明顯增加。以上結(jié)果均說明Cur可以誘導腫瘤細胞自噬。我們又進一步使用了自噬的抑制劑3-MA進行研究，發(fā)現(xiàn)當給予3-MA抑制T24細胞自噬活動后，能夠部分的逆轉(zhuǎn)Cur對腫瘤細胞的殺傷作用(圖3)，表明T24的凋亡誘導作用是通過激活自噬發(fā)揮作用的。已有研究表明某些天然化合物具有激活自噬，誘導腫瘤細胞凋亡的作用[10]，我們的結(jié)果表明Cur可能也具有相類似的作用機制。更有意義的是，我們使用了膀胱癌治療常用的化療藥物CDDP進行試驗，發(fā)現(xiàn)Cur能夠增強CDDP的藥效，推測該作用可能與Cur的自噬激活作用有關(guān)。

本研究從體外水平驗證了Cur的抗膀胱癌作用，并初步闡明了其作用機制，表明Cur的細胞凋亡誘導效應與自噬激活有關(guān)，聯(lián)合應用Cur能夠增強CDDP的藥效，從而豐富了Cur的抗腫瘤譜，拓寬了Cur的應用，為Cur的臨床使用提供了實驗依據(jù)。

參考文獻

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